酱油中呋喃酮类物质的研究进展

王嘉瑞，李青卓，张小龙，付彩霞，汪超，徐宁*

(1.湖北工业大学 生物工程与食品学院 湖北省食品发酵工程技术研究中心，武汉 430068；2.湖北土老憨生态农业科技股份有限公司，湖北 宜昌 443000)

酱油起源于中国，是由酱演变而来的，至今已有两千多年的历史。自周朝时期(公元前1046年-前256年)已经有了酱油的记载，元、明、清以后，酱油被广泛应用于烹饪菜肴中，成为百姓日常生活中重要的调味佳品[1]。

酱油是以大豆或豆粕为主要原料，辅以面粉、小麦、麸皮等淀粉质原料，在微生物的发酵作用下形成的。酱油富含生理活性物质，在抗肿瘤、抗氧化、降低胆固醇、防治心血管疾病等方面都有重要的功效[2]。酱油的色、香、味俱全，含有多种挥发性风味物质，其中对酱香味贡献最大的是呋喃酮类物质。呋喃酮类物质为酱油贡献焦糖香味和酱香味，在酱油酿造过程中产生HDMF和HEMF，与酵母菌生长代谢息息相关，发酵条件的不同(底物、氨基酸、糖类、温度、pH等)会极大地影响微生物的生长代谢，最终影响呋喃酮类物质的合成，从而影响酱油的风味品质。

1 酱油的风味物质

酱油的类型主要是由酱油的风味决定的，生产工艺及微生物种类和含量的不同会影响酱油的品质[3]。国内外研究者们采用不同的定性或定量方法已经鉴定出许多种对酱油风味有贡献的风味物质，在中国传统酱油、日本味噌、泰国鱼露等中共有一千多种挥发性风味物质被检测出。主要的挥发性风味物质包含酸类、醇类、醛类、酮类、酚类、酯类、吡嗪类、呋喃(酮)类、吡喃(酮)类、吡咯类、吡啶类、含硫化合物及含氮化合物等，其中报道10次以上的化合物有66种[4]，不同种类的酱油中风味物质的数量和组成差异很大。酱油特征香味中最突出的是焦糖香、烤香、果香、麦芽香，苯乙醇、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、异丁酸乙酯、3-甲硫基丙醛、苯乙醛、麦芽酚、HEMF(2个互变异构体)、葫芦巴、HDMF和愈创木酚等为高盐稀态酱油的关键香气活性化合物，对酱油香气贡献最大。

在酱油制曲、酱醪发酵阶段，挥发性物质发生显著变化，制曲阶段醛类物质累积，酱醪发酵阶段酯、酸、呋喃酮类物质显著增加，此过程中不仅生成对酱油香气贡献较大的挥发性风味物质，也为后续发酵提供各种酶类和挥发性风味物质前体物质。

呋喃酮类物质是酱油中香气贡献较大且种类较多的一类，主要在酱油发酵阶段产生，其中最重要的两种呋喃酮类化合物为HEMF和HDMF。HEMF是酱油焦糖香气的特殊成分，在香味阈值较低时(水中0.02 mg/L)就能产生明显的焦糖香、甜果香、酱香，HDMF也具有焦糖香气，其在水中的风味阈值为0.16 mg/L，4-羟基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮(HMF)和糠醛的风味阈值较高，但也能为酱油贡献酱香味。

酱油风味的形成机制十分复杂，与原料种类、原料配比、菌种、生产工艺及管理技术等有关[5]。发酵过程中微生物生长代谢，会极大地影响酱油的风味和品质[6]。在酱油的高盐稀态发酵过程中，除了会添加米曲霉外，还会添加乳酸菌、耐高盐增香酵母菌等，在微生物的协同作用下，能产生有机酸、醇、酯等，这些菌株促成了发酵酱油中多种香气物质的生成，能够改善酱油的风味以提高酱油的质量[7-8]。较常见的耐盐增香酵母菌有鲁氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)、易变球拟酵母(Torulopsisversatilis)和埃切假丝酵母(Candidaetchellsii)[9]。酱油酿造过程中，鲁氏接合酵母能够通过生物合成途径或者氨基酸分解代谢途径形成乙醇、高级醇和4-羟基呋喃酮类等物质，调整酱油的香气成分，影响发酵产品的口感，易变球拟酵母能产生酚类化合物如4-乙基愈创木酚和4-乙基酚，这两种物质分别赋予酱油丁香香味和烟熏味，对酱油风味的形成起到重要作用[10]。

2 呋喃酮类物质

呋喃酮类物质是杂环香体类呋喃同系衍生物中极其重要的一类化合物，用途极为广泛，是美国食用香料制造者协会(FEMA)认可的安全食用香料，我国《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》中也允许使用，被业界称为“香料之王”[11]。

2.1 呋喃酮类物质的发现

HDMF最早是在1965年被发现的，Rodin等[12]在菠萝中发现并用乙醚萃取液首次分离出了呋喃酮，确定了其分子结构式。1966年Henry等合成出HDMF[13]。1976年，HEMF首次在酱油中被分离出来，被认为是酱油香气的主体成分[14]。随后人们陆续从草莓、芒果、牛肉汤、烤面包、杏仁、榛子等物质中发现HDMF[15-16]，除了水果，某些昆虫、细菌中也能分离出HDMF[17]，而HEMF主要存在于啤酒、味噌等发酵食品中。

2.2 呋喃酮类物质的应用

HEMF可用于酱油，增添独特喜人的酱香味，并提升我国酱油的质量；可用于白酒，增加酒的酱香味，使其气味醇厚，回味悠长；可用于果香型色酒，增加天然水果香味。HDMF是食品中重要的甜味香料和优良的增香剂，可用于味噌、啤酒和奶酪中，也可用于调配菠萝、草莓、牛肉等食用香精，具有显著增香、柔和及清新作用；用于牙膏及香烟中，能够掩盖杂气，除辣味，改善味道及增强香味，医学上还可用来预防及治疗白内障[18]。

2.3 微生物发酵法产呋喃酮类物质

呋喃酮类物质在天然产物中含量很低，不能满足日常所需，且提取纯化成本较高，现在食品行业多以乳酸乙酯或1,2-丙二醇为原料制得呋喃酮。但化学合成法存在步骤多、产率低、溶剂残留等问题。国内外研究多次报道在由酵母菌、乳酸菌等发酵的食品味噌、奶酪、啤酒等中发现或提取出HDMF，研究发现鲁氏酵母、毕赤酵母、酿酒酵母、乳酸菌等微生物均能生成HDMF，鲁氏酵母、埃切假丝酵母等还能够产生HEMF。利用微生物发酵法制备呋喃酮可以通过调控微生物的生长代谢朝着呋喃酮产物合成的方向进行，且能够实现目标产物的绿色生产[19]。因此，研究微生物生长代谢产生HEMF和HDMF增加酿造酱油中呋喃酮类物质含量是可行的。

3 HDMF和HEMF的形成机制

由表1可知，在酱油发酵过程中形成呋喃酮类物质主要有美拉德反应和酵母代谢两种途径。糖类物质和氨基酸通过美拉德反应可以形成HMF和HDMF，美拉德反应并不能直接生成HEMF，但能够生成HEMF的前体物质，被酵母代谢生成HEMF。HDMF的生成大部分来源于美拉德反应，但也有一部分来自于酵母代谢，HEMF则主要是酵母菌代谢乙醛与美拉德反应中间代谢产物产生，HMF的形成与酵母生长无关，是几种糖与磷酸盐的非酶促反应形成。

表1 酱油发酵过程中几种呋喃酮类物质的来源

3.1 美拉德反应途径

糖类物质和氨基化合物在高温下会发生美拉德反应，经过复杂的过程最后生成大分子物质，首先在酸性条件下经过1,2-烯醇化反应，生成羰基甲呋喃醛，随后在碱性条件下经2,3-烯醇化反应，产生还原酮类和脱氢还原酮类，有利于Amadori重排产物形成1-氨基-1-脱氧-2-酮糖(1-deoxysome)，它是许多食品香味的前驱体，最后Strecker降解反应：继续进行裂解反应，形成含羰基和双羰基化合物，以进行最后阶段反应或与氨基进行Strecker分解反应，产生Strecker醛类。

戊糖和己糖都可与甘氨酸和丙氨酸通过美拉德反应和酵母代谢生成HEMF和HDMF的过程见图1。

图1 HDMF和HEMF的形成途径

通过美拉德反应，戊糖和氨基酸在加热条件下产生Amadori化合物(a)，随后通过2,3-烯醇化(b)形成C5-1-脱氧二酮糖，酮/烯醇异构化(C)，脱水环化(d,e)后形成HMF，己糖与氨基酸进行类似的反应形成C6-1-脱氧二酮糖后脱水环化形成HDMF[20]。

己糖可通过美拉德反应生成HDMF，戊糖可通过美拉德反应生成HMF，糖的碳骨架是形成呋喃酮类物质环形碳骨架的决定因素。美拉德反应生成HDMF和HMF是一种非酶促反应，此过程没有酵母参与也能够进行。美拉德反应产生的HMF前体物质与乙醛发生醇醛缩合(Knoevenagel缩合)(g,c)自发生成EDHMF，EDHMF能够被酵母菌代谢产生的酶转化成HEMF(i)。

3.2 酵母代谢途径

HEMF的形成很可能与戊糖磷酸途径的中间产物有关，戊糖磷酸盐途径是酵母产生HEMF最重要的途径[21]。美拉德反应的中间产物C5-1-脱氧二酮糖可以与甘氨酸或丙氨酸的Strecker降解(f)产物甲醛和乙醛或者是糖片段化(h)产生的甲醛和乙醛通过2,3-烯醇化(b)形成C6-1-脱氧二酮糖和C7-1-脱氧二酮糖，随后脱水缩合碳链环化(d,e)产生环状中间体，通过酮/烯醇互变异构(c)还原成HDMF和HEMF，此步骤需要酵母菌参与代谢(i)，HEMF五元环的骨架和侧链的甲基是由核糖形成的，乙基则来自于酵母利用丙氨酸Strecker降解产物(或是糖片段化(h)性的)乙醛[22]。戊糖和甘氨酸或丙氨酸通过美拉德反应和酵母代谢可以生成HDMF和HEMF。

草莓和番茄果实中有一种烯酮氧化还原酶，能够催化HDMF的合成[23]。酵母中HEMF的形成是一种酶促反应，通过酵母菌产生的酶也可催化HDMF的生成。酵母菌内含有一种YNL134C基因，能够编码与植物的烯酮氧化还原酶(enone oxidoreductase)具有低序列同源性的醛还原酶，能够调控HDMF和HEMF的合成。YNL134C基因编码是一种醛还原酶活性的新型蛋白，由酵母细胞合成并释放到体外，可以将多种醛还原成相应的醇，将糠醛和HMF解毒成毒性较低的2-呋喃甲醇(FM)和呋喃-2,5-二甲醇(FDM)[24]。糖类与氨基酸的美拉德反应产物、乙醛和NADPH在加热条件下能够生成EDHMF，在添加YNL134C编码的酶后还原成HEMF[25]。此外，鲁氏酵母中还含有17种与酵母生长代谢EMP途径和戊糖磷酸途径相关的基因，能够影响HDMF和HEMF的生物合成[26]。

研究发现敲除YNL134C基因导致酿酒酵母HEMF产量下降。而多克隆表达该基因导致HEMF产量增加，因此可以通过找寻能添加到酱油酿造中包含类似于YNL134C基因编码的醛还原酶以及类似植物烯酮氧化还原酶的基因的高产HEMF微生物来完善酱油中呋喃酮类物质的形成机制，也可以通过基因改造积累产生呋喃酮类物质的前体物质，通过调控微生物中催化HEMF和HDMF合成的酶的基因来增加HEMF和HDMF的含量[27]。

3.3 HDMF和HEMF合成的影响因素

HDMF的生成大部分来源于美拉德反应，在加热条件下HDMF的含量明显增加，加入酵母后含量无明显变化。HEMF不能由美拉德反应直接产生，是由酵母菌代谢乙醛和美拉德反应中间产物生成。培养基的理化条件不同，如不同的底物、不同的氨基酸、不同的糖类添加、不同的接种方式、不同的生产工艺均会影响微生物的生长环境和生长代谢，最终影响HDMF和HEMF的合成。有研究表明，培养基的NaCl浓度和pH能影响鲁氏酵母的生长代谢，在菌体能正常生长的前提下高盐浓度更能促进HDMF和HEMF的合成，可能是高盐条件下细胞通透性改变，对底物有更高的选择性[28]。

在酱油体系中，鲁氏酵母可利用不同的糖类和氨基酸类物质生成呋喃酮类物质，有研究表明添加五碳糖更能增加酱油的酱香味和烟熏味，可能是因为五碳糖不易被微生物生长作为能源，但却是美拉德反应重要的前体物质，添加1,6-二磷酸果糖更容易被酵母菌利用，也能够增加HDMF和HEMF的产量[29]。不同的氨基酸添加对酵母合成呋喃酮有不同的影响，除酪氨酸(Tyr)对C.etchellsii产HEMF有抑制作用外，其余19种氨基酸均有不同的促进作用，其中，丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、甘氨酸(Gly)和赖氨酸(Lys)的促进作用最明显[30]。因此可以通过改变微生物的生长环境来影响微生物的代谢，让结果朝着更有利于酵母菌生长和产生更多香气成分呋喃酮的方向发展。

4 发展与展望

传统的酱油酿造是指前人无意识地利用了自然的混菌发酵，由自然环境中多种微生物群体参与，微生物之间拮抗共生，产生了丰富的酶系，使传统酿造的酱油具有很好的风味。现代酱油酿造工艺往往是纯种发酵，通过精准调控生产工艺来严格控制酱油的品质。目前人们对发酵酱油的工艺机理，尤其是发酵酱油用功能微生物缺乏深刻认识和系统研究。随着生活水平的提高，人们对酱油风味的要求越来越高，酱油的风味已成为食品生产者和消费者关注的问题。原材料的配比、接种微生物的种类以及生产工艺决定了酱油的色、香、味。了解酱油风味物质的种类及其产生的机制对于如何改造耐高盐增香酵母从而改善酱油风味及提高酱油质量至关重要，为进一步精准调控发酵调味品风味提供了思路。