甘蔗果醋澄清工艺优化及理化性质分析

黄钰，王凯，伍雅励，赵文梅，陈禹锜，李楠

(广西大学 生命科学与技术学院，南宁 530004)

甘蔗(sugarcane)为多年生高大实心草木，主要生长于热带和亚热带地区[1]。中国的甘蔗产量位居世界第三，广西是全国最大的甘蔗产地，但是目前广西地区的甘蔗基本应用于制糖业，为更好地发挥其地理优势，如何扩大甘蔗加工这一问题急需解决[2]。近年来，随着大众对健康生活的不断追求，果醋因具有保健功效和能保留水果中原有的营养成分等优点，深受人们喜爱[3]。果醋不仅含有人体所需的各种氨基酸、维生素和有机酸类物质[4]，还具有抗氧化、降血糖和降胆固醇等作用[5]。因此，将甘蔗加工成甘蔗果醋是一种有效的解决方法。甘蔗有充足的糖分和水分以及丰富的维生素和矿物质，对人体新陈代谢有极大益处[6]。甘蔗果醋含有多酚和黄酮等物质，多酚具有较强的抗氧化功能[7]，黄酮可以清除人体中的游离自由基，起到延缓衰老的作用[8]。但甘蔗果醋含有大量蛋白质、纤维素和果胶等物质，在生产和储存时上述物质会发生聚合作用产生沉淀物，导致甘蔗果醋浑浊[9]，严重影响人们的感官体验。酸性蛋白酶是一种蛋白酶，能在较低pH下水解蛋白质[10]，也能够将甘蔗果醋中的蛋白质水解为氨基酸和多肽，进而使其沉淀。为解决甘蔗果醋中的非生物性浑浊沉淀的问题，本试验利用酸性蛋白酶来处理甘蔗果醋，并利用响应面法优化酸性蛋白酶对甘蔗果醋的澄清效果，以达到最佳澄清效果。通过甘蔗果醋感官评价表，对在最佳澄清条件下澄清前后的甘蔗果醋进行评价打分，并测定在最佳澄清条件下澄清前后的甘蔗果醋还原糖、总多酚、黄酮、蛋白质及酸度等理化性质，为甘蔗果醋进一步发展利用提供了理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甘蔗：广西农业科学院提供；甘蔗果酒、甘蔗果醋：本实验室自酿；酿酒酵母：安琪酵母股份有限公司；醋酸菌：广西大学生命科学与技术学院朗姆酒研发实验室自筛；酸性蛋白酶：南宁庞博生物工程有限公司。

1.2 仪器与设备

YP201N电子天平 上海菁华科技仪器有限公司；PL-303分析天平 Mettler Toledo有限公司；UV mini-1240紫外-可见分光光度计 岛津仪器(苏州)有限公司；恒温水浴锅、SN510C全自动高压灭菌锅 重庆雅马拓科技有限公司；MQD-S2R摇床 上海旻泉仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 甘蔗果醋酿造工艺

1.3.2 甘蔗果醋澄清单因素试验

酸性蛋白酶添加量：将添加量为0.2‰、0.4‰、0.6‰、0.8‰、1.0‰、1.2‰的酸性蛋白酶分别加入6份甘蔗果醋中，充分混匀后置于50 ℃的恒温水浴锅中，酶解6 h后取出，常温下静置2 d后使用紫外分光光度计在725 nm下测其透光率。

酶解时间：将添加量为0.8‰的酸性蛋白酶加入6份甘蔗果醋中，充分混匀后置于50 ℃的恒温水浴锅中，分别在酶解2，4，6，8，10，12 h后取出，常温下静置2 d后使用紫外分光光度计在725 nm下测其透光率。

酶解温度：将添加量为0.8‰的酸性蛋白酶加入6份甘蔗果醋中，充分混匀后分别置于35，40，45，50，55，60 ℃的恒温水浴锅中，酶解6 h后取出，常温下静置2 d后使用紫外分光光度计在725 nm下测其透光率。

1.3.3 响应面法优化甘蔗果醋澄清工艺试验

根据上述单因素试验结果，选择酸性蛋白酶添加量(A)、酶解时间(B)和酶解温度(C)为影响因素，利用Box-Behnken试验设计进行优化，以透光率(Y)为响应值进行响应面分析。试验设计因素与水平见表1。

表1 Box-Behnken试验设计因素与水平

1.3.4 甘蔗果醋理化性质研究

还原糖含量的测定：采用DNS法[11]；总多酚含量的测定：采用Folin-Ciocalteu法[12]；蛋白质含量的测定：采用考马斯亮蓝法[13]；酸度的测定：采用中和滴定法[14]。

1.3.5 感官评价

将10份甘蔗果醋样品随机分发给10名专业感官评价员，按照色泽、气味、酸度、澄清度及口感5个评分项目对甘蔗果醋进行评价[15]，评分标准见表2。

表2 甘蔗果醋感官评价标准

1.3.6 数据分析

试验所得数据均为3次重复试验测定的平均值，响应面图采用Design-Expert V8.0.6进行分析，采用Graphpad Prism 8.0作图，方差分析和显著性检验(P<0.05)采用SPSS 21.0进行分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验对甘蔗果醋的澄清效果

2.1.1 酸性蛋白酶添加量对甘蔗果醋的澄清效果

在酶解时间为6 h，酶解温度为50 ℃的条件下，考察酸性蛋白酶添加量为0.2‰、0.4‰、0.6‰、0.8‰、1.0‰、1.2‰对甘蔗果醋的澄清效果，结果见图1。

图1 不同酸性蛋白酶添加量对甘蔗果醋透光率的影响

由图1可知，随着酸性蛋白酶添加量的增加，甘蔗果醋的透光率递增，当添加量达到1.0‰时，甘蔗果醋的透光率达到最大值81.1%，之后随着添加量增加，透光率反而下降。因为酸性蛋白酶越多，其分解甘蔗果醋的能力越强，但是酸性蛋白酶过多会导致甘蔗果醋中存在的大分子物质过量，从而有浑浊沉淀形成。综上所述，选择1.0‰为最佳添加量。

2.1.2 酸性蛋白酶酶解时间对甘蔗果醋的澄清效果

在酸性蛋白酶添加量为0.8‰，酶解温度为50 ℃的条件下，考察酶解时间为2，4，6，8，10，12 h对甘蔗果醋的澄清效果，结果见图2。

图2 不同酶解时间对甘蔗果醋透光率的影响

2.1.3 酸性蛋白酶酶解温度对甘蔗果醋的澄清效果

在酸性蛋白酶添加量为0.8‰，酶解时间为6 h的条件下，考察酶解温度为35，40，45，50，55，60 ℃对甘蔗果醋的澄清效果，结果见图3。

图3 不同酶解温度对甘蔗果醋透光率的影响

由图3可知，随着酶解温度的升高，甘蔗果醋的透光率先增加后减少，当酶解温度达到55 ℃时，透光率达到最大值，为86.5%。因为随着酶解温度的升高，酸性蛋白酶活性也随之提高，当达到最适酶解温度的临界点后，温度的增加会影响其酶活，从而减弱澄清效果。综上所述，选择55 ℃为最佳酶解温度。

2.2 响应面优化法对甘蔗果醋的澄清作用

2.2.1 Box-Behnken试验设计方案及试验结果

根据上述单因素试验结果，选择酸性蛋白酶添加量(A)、酶解时间(B)和酶解温度(C)为影响因素，利用Box-Behnken试验设计甘蔗果醋澄清优化试验，以透光率(Y)为响应值进行响应面分析。响应面试验设计与结果见表3，回归模型方差分析结果见表4，方差相关系数见表5。

表3 响应面试验设计与结果

表4 回归模型方差分析结果

表5 方差相关系数

利用分析软件Design-Expert对所得结果进行多元回归方程拟合，得透光率(Y)二次多项回归模型方程：Y=88.38+1.16A+0.40B+0.36C-0.38AB-0.15AC-0.82BC-0.52A2-0.79B2-2.21C2。

由表4可知，模型的P值=0.0201<0.05，达到显著水平，失拟项的P值=0.1579>0.05，为不显著水平，说明模型可靠，拟合性良好。一次项A的P值=0.0106<0.05，说明酸性蛋白酶添加量对甘蔗果醋的澄清效果显著；一次项B和C的P值均大于0.05，说明酶解时间和酶解温度对甘蔗果醋的澄清效果不显著；交互项AB、AC、BC和二次项A2、B2的P值均大于0.05，说明上述因素对甘蔗果醋的澄清效果不显著，酸性蛋白酶添加量、酶解时间和酶解温度之间的交互作用较弱；二次项C2=0.0020<0.01，说明其对甘蔗果醋的澄清效果极显著。由F值可得因素A>B>C，即对甘蔗果醋澄清效果影响顺序为：酸性蛋白酶添加量>酶解时间>酶解温度。

转变教师传统教学思维模式，使其真正意识到信息技术对教学的作用和意义，将信息技术实际运用到教学实践当中，只有当教师的思想改变后才能保证信息化教学的顺利开展。在信息化教学方式下，学生作为教学主体，但并不代表教师在教学中的作用减少，反而是对教师的素质做出了更高的要求，要做好学生的引导者、协调者、促进者和激励者。

由表5可知，拟合度R2=0.8706和校正拟合度RAdj2=0.7042数据相差小，说明所设计的模型与实际试验拟合度较好，可靠性较高；信噪比=6.294>4，说明模型的可信度高；CV=1.10%<5%。综上所述，证明该模型准确性好，可以用来分析各因素变化对响应值的影响。

2.2.2 各影响因素交互作用分析

各因素对指标影响的响应面图见图4。

图4 各因素交互作用对甘蔗果醋澄清度影响的响应曲面

等高线为椭圆，曲面斜度越高，坡度越陡，则各因素对甘蔗果醋澄清度作用越显著。由图4可知，在模型中AB、BC、AC的交互作用不显著，说明与表4所得数据一致。

利用响应面法对回归模型进行分析，选择透光率的最大响应值，得到的最佳响应结果为酸性蛋白酶添加量为1.2‰，酶解时间为3.98 h，酶解温度为55.25 ℃，此优化条件下澄清透光率的预测值为89.03%。为检验试验结果的真实准确性，由于实际操作情况不能精准达到上述优化条件，因此调整为酸性蛋白酶添加量为1.2‰，酶解时间为4 h，酶解温度为55 ℃,在此澄清工艺条件下进行3次验证试验，得到甘蔗果醋的澄清透光率为91.9%，澄清结果与试验预测值相近，说明该模型可靠，可以应用响应面对甘蔗果醋澄清工艺进行优化。

2.3 澄清前后甘蔗果醋理化性质研究结果

由表6可知，经过最佳澄清工艺优化后，甘蔗果醋中还原糖、总多酚、蛋白质及总酸相较澄清前均略有下降。

表6 澄清前后甘蔗果醋理化性质变化

2.4 澄清前后甘蔗果醋感官变化

根据表2对澄清前后甘蔗果醋进行感官评价后的结果为：澄清前的甘蔗果醋呈昏暗深褐色，略有果香和醋味，酸味较刺鼻，不透亮且口感单一，得分为62分；澄清后的果醋呈鲜明琥珀色，有香甜的甘蔗香味，酸味浓厚，十分清透且口感丰富，得分为89分。因此，使用酸性蛋白酶对甘蔗果醋进行澄清具有极佳的感官效果。

3 结论

本试验通过响应面法得到酸性蛋白酶对甘蔗果醋的最佳澄清条件为：酸性蛋白酶添加量为1.2‰，酶解时间为4 h，酶解温度为55 ℃，在此条件下甘蔗果醋的透光率可达到91.9%。甘蔗果醋经最佳澄清条件澄清后，其还原糖、总多酚、蛋白质和总酸均略下降，但影响不大；感官品质有很大的提升，感官评分从62分提高到89分，所得的甘蔗果醋品质极佳，为甘蔗果醋应用于调味品方面提供了理论依据。