不同产地黄芪药材和饮片的HPLC-DAD-ELSD指纹图谱分析△

钟荣荣，李默影，肖苏萍*，王继永，高永坚，张斯杰，周朗，王海蝶

1.中国中药有限公司，北京 102600；2.中国医药工业研究总院 中药创新中心，上海 201203；3.中国中药控股有限公司，广东 佛山 528303 4.江西中医药大学，江西 南昌 330004

黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus(Bge.) Hsiao或膜荚黄芪A.membranaceus(Fisch.) Bge.的干燥根，具有补气升阳、固表止汗、利水消肿、生津养血、行滞通痹、排脓托毒、敛疮生肌之功效[1]。现代研究表明，黄芪中富含皂苷类、黄酮类、多糖类等化合物，对免疫性疾病、机体能量代谢疾病、血液病及心血管疾病等有治疗作用[2]。为了全面评价黄芪药材质量，国内外学者分别建立了不同的指纹图谱方法对其进行分析[3-9]，但对于多批次不同产地黄芪药材和饮片用同一种前处理方法，采取二极管阵列检测器和蒸发光散射检测器联用法(DAD-ELSD)比较分析其指纹图谱，目前还鲜见报道。

本实验采用高效液相色谱-二极管阵列检测器-蒸发光散射检测器联用法(HPLC-DAD-ELSD)建立黄芪药材和饮片指纹图谱分析方法，考察了方法的精密度、稳定性和重复性，确定了23个共有峰，指认了6个指纹峰，并测定分析了40批不同产地黄芪药材和饮片指纹图谱相似度及药材和饮片之间的对应相似性。

1 材料

1.1 仪器

1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦科技公司)；XS205DU型电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；TWJR-B 230×230型加热板(上海百申仪器设备有限公司)；Sigma3-18型台式高速离心机(美国Sigma公司)。

1.2 试药

对照品毛蕊异黄酮葡萄糖苷(批号：111920-201606，纯度≥97%)、芒柄花素(批号：111703-201504，纯度≥98%)均购于中国食品药品检定研究院；对照品3-O-3′，4′-二乙酰基-β-D-吡喃木糖基-6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-环黄芪醇(批号：1324005-51-7，纯度≥97%)、芒柄花苷(批号：R28O8F46957，纯度≥98%)、毛蕊异黄酮(批号：Y24N9Y75652，纯度≥98%)、黄芪皂苷Ⅱ(批号：B20566，纯度≥98%)均购于上海源叶生物科技有限公司；色谱纯乙腈、HPLC级甲酸(赛默飞世尔科技有限公司)；甲醇、无水乙醇均为分析纯(北京化工厂)；水为实验室自制超纯水。

所有黄芪药材和饮片样品经中国中药有限公司王继永研究员鉴定为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao干燥根及切制饮片，样品信息见表1，样品分级标准见表2。

表1 黄芪药材和饮片样品信息

表2 黄芪药材质量分级标准

2 方法与结果

2.1 混合对照品溶液的制备

取对照品毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、黄芪皂苷Ⅱ、3-O-3′，4′-二乙酰基-β-D-吡喃木糖基-6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-环黄芪醇、芒柄花素适量，精密称定，加50%甲醇制成质量浓度为10 μg·mL-1的溶液，即得。

2.2 供试品溶液的制备

精密称取黄芪粗粉5 g，加热回流提取3次，加水量分别为50、40、30 mL，每次1 h。合并滤液，加入乙醇至醇体积分数为70%，静置1 h，4000 r·min-1离心20 min(离心半径为13.5 cm)。取上清液浓缩至干，加水20 mL使溶解，以等体积乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，浓缩至干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.3 色谱条件

采用Agilent Zorbax SB C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，3.5 μm)；以0.5%甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱(0～10 min，90%～80%A；10～30 min，80%～70%A；30～55 min，70%～40%A；55～55.1 min，40%～90%A；55.1～60 min，90%A)；柱温为35 ℃；进样量为10 μL；流速为1 mL·min-1；检测波长为254 nm；ELSD参数：载气气压为241 kPa，漂移管温度为90 ℃；增益为50。

2.4 指纹图谱方法学考察

2.4.1精密度试验 精密吸取S1样品溶液，连续进样6次，以芒柄花苷为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间与相对峰面积。结果表明，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于5%，表明仪器精密度良好。

2.4.2重复性试验 取S1样品6份，按2.2项下方法制备，分别进样测定，以芒柄花苷为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间与相对峰面积。结果表明，各共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于5%，表明本方法重复性良好。

2.4.3稳定性试验 精密吸取S1供试品溶液，分别在0、6、12、18、24 h进样，以芒柄花苷为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间与相对峰面积。结果表明，各共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于5%，表明供试品在24 h内稳定性良好。

2.5 黄芪药材和饮片指纹图谱的建立

取上述40批黄芪样品，分别按2.2项下方法制备，按2.3项下色谱条件进样测定，记录色谱图。采用国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2004A版)软件，对黄芪药材和饮片指纹图谱进行自动匹配，标定共有峰，依次编号。建立40批不同产地黄芪HPLC-ELSD和HPLC-DAD指纹图谱，并进行相似度评价，结果见图1～4和表3。

注：A.对照品；B.黄芪样品对照图谱(R)；7.黄芪皂苷Ⅱ；11.3-O-3′，4′-二乙酰基-β-D-吡喃木糖基-6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-环黄芪醇。图1 黄芪样品HPLC-ELSD指纹图谱对照图谱

图2 黄芪样品HPLC-ELSD指纹图谱

注：A.对照品；B.黄芪样品对照图谱(R)；3.毛蕊异黄酮葡萄糖苷；6.芒柄花苷；9.毛蕊异黄酮；12.芒柄花素。图3 黄芪样品及对照品HPLC-DAD指纹图谱对照图谱

图4 黄芪样品HPLC-DAD指纹图谱

表3 40批黄芪药材和饮片相似度

如图1所示，与对照品比对后，鉴定峰7为黄芪皂苷Ⅱ、峰11为3-O-3′，4′-二乙酰基-β-D-吡喃木糖基-6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-环黄芪醇。

如图3所示，与对照品比对后，鉴定峰3为毛蕊异黄酮葡萄糖苷、峰6为芒柄花苷、峰9为毛蕊异黄酮、峰12为芒柄花素。

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

本实验考察了柱温25、30、35 ℃下的色谱分析情况，根据色谱峰的分离度和峰形效果，选取35 ℃作为最佳柱温。选用Waters-X Bridge C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)和Agilent Zorbax SB C18(150 mm×4.6 mm，3.5 μm)色谱柱进行分析，结果表明，Waters-X Bridge C18和Agilent C18色谱柱的色谱峰分离度较差且时间较长，效率低，故最终选用Agilent Zorbax SB C18(150 mm×4.6 mm，3.5 μm)色谱柱。对ELSD参数进行了考察，最终条件为漂移管温度90 ℃，检测器增益50，气体压力241 kPa。

3.2 相似度评价分析

本实验建立的指纹图谱方法能较全面地反映黄芪药材和饮片中的黄酮类和皂苷类成分，可为黄芪药材和饮片质量控制提供参考，具有较强的实用性。比较药材与其对应的切制饮片的指纹图谱，除山西产的药材样品相似度为0.86外，药材和饮片DAD指纹图谱相似度均大于0.94，ELSD指纹图谱相似度均大于0.89，说明黄芪饮片切制、干燥过程对药材成分影响较小。

除2个样品外，DAD均比ELSD指纹图谱相似度高，这可能与DAD只对有光吸收的化合物适用有关，专属性更强，响应干扰小，相似度更高。

40批6个不同产地的黄芪药材和饮片中，除山西、内蒙古产的2个样品相似度为0.860和0.868外，DAD指纹图谱相似度均大于0.92，除甘肃产的1个样品为0.783外，ELSD指纹图谱相似度均大于0.85，提示产地对黄芪质量有一定影响。

3.3 黄芪等级分析

传统的药材分级方法多注重于外观性状，通常是根据药材的个头大小、质地、颜色、味道等。本研究中32批划分等级的黄芪药材以上、下端直径大小进行分级，但不同等级黄芪药材样品中，DAD和ELSD指纹图谱相似度均没有发现规律性，提示等级间黄芪质量不均一，这可能与黄芪化学成分之间可能存在相互转化等情况有关[10]，也可能为黄芪药材划分等级的标准不适用，后续可继续进行黄芪药材分等级指标研究。

3.4 指纹图谱分析

由指纹图谱可见，各峰分离较好，利用DAD和ELSD 2种检测器联用方法对黄芪皂苷类和黄酮类成分进行了全面分析，同时供试品制备方法相对简单、易操作，本方法可用于定性评价黄芪药材和饮片质量。