基于网络药理学探究兰艾双香方治疗细菌感染的机制研究*

宋 健，孟凯强，张振华，张瑞凡，王紫慧，胥 冰，王 斌，沈舒文，杨燕燕

（1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；2.陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳 712000）

细菌感染是常见的微生物侵体类型，细菌感染可作为诱导因素，诱导其他疾病的发生发展，也可由其他疾病诱发。关于细菌感染的治疗也是多种多样的，常规的抗生素治疗，噬菌体治疗等。由于抗生素的滥用，抗生素耐药性时常发生[1-2]，新的治疗策略就显得非常有意义。

越来越多的临床数据证明传统医学理论指导下的遣方用药在治疗细菌感染方面疗效显著[3]，兰艾双香方是名老中医沈舒文教授扎实的中医理论和丰富中医临床经验的凝练，多年来一直作为治疗细菌感染临床基础方，其组成有羌活、独活、石菖蒲、藿香、苍术、丁香、薄荷、贯众、苦杏仁、佩兰、艾叶，该方临床中取得了良好的疗效。

网络药理学（network pharmacology，NP）是以整体性和系统性为特性强调多成分、多靶点、多疾病之间的相互作用，通过使用网络药理学可提高效率，降低开发成本，也适用于中医药的研究与开发。作为一项研究手段，网络药理学迅速发展，形成了一系列成熟的数据方法、平台和软件，如中药系统药理数据库与分析平台（TCMSP）可对中药成分进行筛选、获取成分-靶点-疾病关系；Gene Cards，OMIM 和 DigSee 3个数据库集成包括基因组、蛋白质组、功能信息等资源；STRING数据库可以预测药物与蛋白质之间相互作用；Cytoscape软件用于分子互作网络及生物途径可视化；Metascape用于对靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析等。

1 资料和方法Data and methods

1.1 兰艾双香方活性成分的获取及靶点筛选 利用TCMSP数据库收集兰艾双香方中羌活、独活、石菖蒲、藿香、苍术、丁香、薄荷、贯众、苦杏仁、佩兰和艾叶的化学成分[4-6]，以口服生物利用度（OB≥30%）和类药性（DL≥0.18）为指标进行筛选，确定其活性成分。通过TCMSP和Drug Bank数据库查询活性成分相对应的靶标蛋白，并利用Unitprot数据库查询靶标蛋白对应的基因名称，筛选人类的靶点蛋白，最终整理得到兰艾双香方的活性成分及其对应靶点。

1.2 细菌感染靶点筛选预测 利用Gene Cards，OMIM和DigSee 3个数据库，以“bacterial infection”为关键词，对细菌感染相关靶点进行检索及筛选，将3个数据库筛选结果合并，删除重复项后得到细菌感染的相关靶标信息。

1.3 网络构建与分析 利用jvenn平台做出韦恩图将所得药物活性成分靶点与细菌感染疾病靶点相映射，得到兰艾双香方治疗细菌感染的预测靶点。将交集得到的靶点导入String数据库，构建“蛋白质-蛋白质”相互作用网络，并用Cytoscape 3.8.0软件中的CytoNCA插件对所得的蛋白质相互作用网络数据进行分析，借助度中心性（DC）和介度中心性（BC）指标进行筛选，筛选完成后根据初筛结果继续筛选大于每个指标所对应的中位数的节点，得到兰艾双香方治疗细菌感染的关键靶点[7-8]。

1.4 GO富集分析与KEGG富集分析 通过Metascape中对兰艾双香方治疗细菌感染的作用靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，分别研究兰艾双香方治疗细菌感染的主要生物功能与主要信号通路，其中P＜0.05代表富集结果显著，并通过Metascape制作GO富集分析图及KEGG富集分析气泡图[9-12]。

1.5 KEGG关系网络构建 先分别建立通路、基因相互作用关系和节点属性、基因相互作用关系，并导入Cytoscape 3.8.0软件中，选取主要的KEGG信号通路，构建兰艾双香方治疗细菌感染的“KEGG-基因”的关系网络图。

1.6 主要观察指标 ①单味药-活性成分-作用关键化合物成分；②PPI网络及网络拓扑分析后兰艾双香方关键蛋白基因；③筛选后关键基因在KEGG和GO富集的结果。

2 结果

2.1 活性化合物的筛选结果 利用TCMSP数据库检索共收集得到兰艾双香方的化学成分，根据口服生物利用度（OB≥30%）和类药性（DL≥0.18）为指标进行筛选，得到复方中共110个活性化学成分，羌活（15个）、独活（9个）、石菖蒲（4个）、藿香（11个）、苍术（9个）、丁香（6个）、薄荷（10个）、贯众（7个）、苦杏仁（19个）、佩兰（11个）和艾叶（9个）的化学成分，活性成分的基本信息见表1，相同活性成分对比见表2。通过TCMSP数据库得到兰艾双香方中活性成分靶点1 788个，通过验证筛选最终确定有效靶点245个，利用Cytoscape 3.8.0软件将兰艾双香方的复方活性成分及作用靶点进行分析整理得到图1，其中菱形代表作用靶点在中间呈长方形排列，六边形为中药的有效成分，圆形为中药，具体对应见表3。

图1 兰艾双香方单味药-活性成分-靶点网络图

表1 兰艾双香方中活性化合物基本信息

续表1

续表1

续表1

表2 相同活性成分对比表

表3 兰艾双香方网络图物质代表符号

2.2 兰艾双香方治疗细菌感染潜在作用靶点预测将以细菌感染的英文“bacterial infection”为关键词检索Gene Cards，OMIM和DigSee 3个数据库，整理筛选后获得细菌感染的有效靶点1 442个。将靶点数据导入jvenn平台做出韦恩图（图2），即兰艾双香方治疗细菌感染的潜在作用115个靶点。

图2 韦恩图

2.3 兰艾双香方治疗细菌感染的作用靶标的蛋白质相互作用网络及核心靶点的筛选 利用蛋白质相互作用数据库STRING分析兰艾双香方治疗细菌感染的靶点，物种选择为“Homo sapiens”，得到蛋白相互作用关系（proteinprotein interaction，PPI）网络图图3A，为了更加直观的展示，将设置自定义值置信度（“custom value confidence（0.950）”），获得蛋白相互作用关系（proteinprotein interaction，PPI）网络图图3B，并隐藏在该网络中与其他靶标无互作关系的靶标。

图3A 蛋白相互作用关系网络图

图3B 蛋白相互作用关系网络图

2.4 PPI网络分析结果 筛选后结果显示，该网络包含97个节点及1 428条边，其中平均节点度值为22.31，见图4。以节点度值为评价参数，度值越大说明其在PPI网络中越重要，可能在发挥生物学功能中起着重要的作用。度值排名前10的靶点为原癌基因c-Jun（Jun）、肿瘤坏死因子（TNF）、肿瘤蛋白 p53（TP53）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、细胞核因子kp65（RELA）、白细胞介素-6（IL-6）、丝裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 1（Akt1）、胱天蛋白酶 8（CASP8）、原癌基因 c-FOS（FOS），这些靶点可能是兰艾双香方治疗细菌感染的关键靶点。

2.5 蛋白模块筛选分析结果 通过Metascape数据库分析得知，红色区蛋白模块代表细胞周期负调控、凋亡信号通路、细胞增殖的负调控；蓝色蛋白模块代表对金属离子的反应、对无机物的反应、造血正调控；绿色蛋白模块代表脂质转运、脂质定位、脂质转运的调节；紫色蛋白模块代表长链脂肪酸生物合成过程、长链脂肪酸代谢过程、异源代谢过程。见图4。

图4 兰艾双香方治疗细菌感染靶点蛋白互作模块

2.6 GO富集分析及KEGG通路分析结果 通过Metascape共筛选得到 GO 条目 2401个（P＜0.05），其中生物过程（Biological processes，BP）条目 2 172个，分子功能（molecular function，MF）条目 149个，细胞组成（cell composition，CC）条目 80个，分别占 90%，6%，4%，其中生物过程主要涉及对脂多糖的反应、对无机物质的反应、对有毒物质的反应、活性氧的代谢过程和对受伤的反应等；分子功能主要涉及细胞因子受体结合、蛋白质结构域特异性结合、蛋白激酶结合、蛋白质同二聚活性和磷酸酶结合等方面；细胞组成方面主要涉及膜筏、囊泡腔、细胞质核周区、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合物和细胞外基质等方面。各类别前20的条目见图5。KEGG通路富集筛选得到324条信号通路（P＜0.05），其中排名前20的条目见图6，根据KEGG绘制的气泡图见图7。根据KEGG结果在Cytoscape 3.8.0中绘制了重要靶点通路见图8。

图5 兰艾双香方活性成分治疗活性成分潜在靶点GO生物学过程、分子功能、细胞成分富集分析

图6 兰艾双香方活性成分治疗细菌感染潜在靶点KEGG通路富集分析

图7 兰艾双香方活性成分治疗细菌感染潜在靶点的KEGG通路气泡图

图8 兰艾双香方靶点通路图

3 讨论

细菌感染是致病菌侵入血液循环系统后进行生长繁殖，产生毒素和其它代谢产物，所引起的全身急性感染[13]。细菌感染常合并其他疾病，当疾病进展过程中出现细菌感染时，疾病的进展将向危重期发展[14-15]。抗菌抗感染的治疗对癌症、糖尿病和乙型肝炎等疾病尤为重要。扶正祛邪、调和阴阳为主的中医理论在感染性疾病的治疗中疗效显著，木其尔等[16]总结论述了中医药对于重症脑病的治疗实验研究以及临床观察数据，得出了中医药治疗重症脑病疗效显著。郜贺等[17]总结了白长川教授运用中医药治疗感染性休克的经验。芮庆林等[18]研究发现中药对重症肺炎发生细菌耐药感染有明显的干预作用，可减少耐药发生，改善预后，减少严重并发症，减少死亡率，对于减少重症肺炎耐药感染发生及治疗预后有着积极的临床意义。通过网络药理学的分析，兰艾双香方治疗细菌感染的关 键 基 因 有 Jun、TNF、TP53、MAPK1、RELA、IL-6、MAPK3、Akt1、CASP8、FOS 等。细胞因子中的 TNF、IL-6是比较重要的指标，在细菌感染诊断中具有非常重要价值[19]。兰艾双香方的关键基因包含TNF和IL-6，进一步证实了关键基因发挥抗菌作用的可靠性。Jun基因的作用是识别并结合AP-1基序5'-TGA[CG]TCA-3'的转录因子。当被HIPK3磷酸化时，促进NR5A1的活性，从而在cAMP信号通路刺激后导致类固醇生成基因表达增加。参与大肠癌（CRC）细胞中USP28的激活的KRAS介导的转录激活。与结直肠癌（CRC）细胞中的USP28启动子结合。TP53是细胞内关键的感应因子，是调节应激反应的重要因素，与先天性抗病毒免疫、细胞凋亡及病毒的复制与转录都有关系[20]。Akt1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，具有抑制细胞凋亡和调节代谢作用[20-21]。RELA蛋白主要在细胞质发挥功能，在细菌之间高度保守，与大肠埃希菌RelA亲缘关系最近的是福氏志贺菌，其次是柯氏柠檬酸杆菌，其在细胞生命活动中具有重要功能，RelA通过与核糖体和tRNA的相互作用介导细菌的严谨反应，因此RelA是一种重要的翻译因子[22]。MAPK1和MAPK3是在MAPK/ERK级联中起重要作用的2个MAPK。它们还参与由激活的KIT和KITLG/SCF发起的信号级联。根据细胞情况，MAPK/ERK级联通过调节转录，翻译，细胞骨架重排来介导多种生物学功能，例如细胞生长、粘附、存活和分化。MAPK/ERK级联通过磷酸化许多转录因子，在分化细胞的减数分裂，有丝分裂和有丝分裂后功能的启动和调节中也起作用。此外，MAPK/ERK级联还参与内体动力学的调节，包括溶酶体加工和通过核周再循环室（PNRC）的内体循环；以及有丝分裂期间高尔基体的破碎。胱天蛋白酶激活级联的大多数上游蛋白酶负责TNFRSF6/FAS介导的和TNFRSF1A诱导的细胞死亡。结合衔接子分子FADD会将其募集至任一受体，所得的称为死亡诱导信号复合物（DISC）的聚集体执行CASP8蛋白水解激活。然后将活性二聚酶从DISC中释放出来，并释放以激活下游的凋亡蛋白酶。N末端前肽的蛋白水解片段（称为CAP3，CAP5和CAP6）可能保留在DISC中。切割并激活CASP3，CASP4，CASP6，CASP7，CASP9 和 CASP10。可能参与了GZMB的凋亡途径。FOS是一种原癌基因，在正常人类细胞中可检测到极低水平的表达，与细胞的生长、增殖活化有关[23]。

网络药理学在中医药研究过程中能够解决一些问题[24]，但也存在一定的缺陷，比如主要通过数据库进行检索，通过参数的设定来对成分进行筛选，但这些数据库可能还有待完善，而参数值的确定目前也尚有争论。通过网络药理学相关数据库对兰艾双香方的研究我们得到以下科研结果：①筛选得到兰艾双香方共110个药效成分和1 788个作用靶点，关键靶点包括过氧化物酶体增殖物激活受体、血管内皮生长因子A、肿瘤坏死因子和表皮生长因子受体等；②细菌感染相关靶点1 442个；③蛋白互作核心网络共97个蛋白，分析得到4个蛋白模块；④获得2 401个GO生物过程，KEGG通路富集筛选得到324条相关信号通路，通路类型包括癌症的路径、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、乙型肝炎、肿瘤坏死因子信号通路、小细胞肺癌、利什曼病、HIF-1信号通路、军团杆菌病等，这些通路均与细菌感染的发生发展相关；⑤结果证实，兰艾双香方可能通过调节细胞代谢、增殖与凋亡、脂代谢等多种途径达到治疗细菌感染的目的，是多成分、多靶点和多通路相互作用的结果。

兰艾双香方是沈舒文教授基于中医“正气存内，邪不可干”理论，针对细菌感染的“湿热”特性[24]组建的复方，方剂由羌活、独活、石菖蒲、藿香、苍术、丁香、薄荷、贯众、苦杏仁、佩兰、艾叶10味中药组成，以芳香类药物为主，佐以发汗解表，使外邪透表而出。藿香[25]味辛，性微温，归脾、胃、肺经，芳香化湿，醒脾开胃；薄荷[26]味辛，性凉入肺、肝经，疏散风热，清利头目，利咽透疹，疏肝行气，二药共为君药，行芳香化湿，解表透邪之效。羌活味辛、苦，性温，入膀胱、肾经，解表散寒，祛风胜湿；独活味辛、苦，性微温，归肾、膀胱经，祛风除湿，通痹止痛；石菖蒲味辛，性温。归心、胃经，祛痰开窍，化湿开胃，宁神益智，3药共为臣药，助君药化湿之功。丁香，贯众，苦杏仁，佩兰，艾叶共为佐药，辅助君臣行祛湿化浊之效。

对于名老中医沈舒文教授临床常用经验方兰艾双香方，通过网络药理学的研究[27]，发现兰艾双香方对于癌症、糖尿病、乙型肝炎等疾病并发细菌感染的治疗具有良好的疗效，尤其是以癌症进展过程中的细菌感染。通过对兰艾双香方的网络药理学分析，进一步验证兰艾双香方临床疗效的科学性，为兰艾双香方的临床应用和进一步研究提供了科学依据。