基于分子网络的半枝莲-白花蛇舌草治疗胃癌的多尺度作用机制研究*

徐 缘，丁 然，骞珊娜，冯 杰，姚 娟，王景辉

（安徽中医药大学中西医结合学院，安徽 合肥 230012）

胃癌（gastric carcinoma，GC）逐渐成为全球的棘手问题[1]。当前西医治疗胃癌的方式主要是放疗与化疗，另外涉及有免疫、靶向治疗等[2]。然而胃癌患者的死亡率5年高达75%以上，且这些治疗大都存在较为严重的不良反应[3]。中医药治疗作为中国传统治疗特色方法，随着中医学科的发展，中医治疗的运用也变得越来越广泛[4]。半枝莲又名并头草、韩信草等，《中华人民共和国药典》（2020版）中记载其为唇形科植物的干燥全草，其性味辛，苦，寒，归于肺，肝，肾经。有清热解毒，散瘀利尿之功效，可用于治疗疔疮肿毒、咽喉肿痛、水肿、黄疸、毒蛇咬伤[5]。现代药理学研究表明，半枝莲中所含黄酮类、二萜类、内酯类及多糖类化合物等具有抗癌，抗病毒以及促进细胞免疫功能的作用[6]。中药白花蛇舌草又名羊须草、蛇舌草、蛇总管等，为茜草科耳草属植物，性味甘，淡，凉，并入胃，大、小肠经，有清热解毒，利尿消肿，止痛活血之功效，用于治疗肺热喘咳、肠痈、痢疾、湿热黄疸、咽喉肿痛等疾病，亦擅长治疗多种癌肿。现代药理学研究发现白花蛇舌草中所含黄酮类、蒽醌类化合物等可以抑制肿瘤细胞的生长并促进其凋亡[6-7]。半枝莲与白花蛇舌草亦分别可见于《江苏植药志》《广西中药志》，两者具有多种生物活性，联合使用可清热解毒、散瘀止血、利尿、消除肿胀与结节等，也常运用于治疗多种癌症疾病与炎症[7-8]。由目前的中医学科研究来看，联合用药往往相较于单味用药效果更佳[9-10]。

临床疗效与现代的药理学研究都表明，半枝莲-白花蛇舌草可以对癌症抑制、炎症消除及免疫调节等多方面都有比较好的功效[11-12]。本研究采用的是网络药理学与分子对接等技术手段，基于分子水平上更深层次地揭示半枝莲-白花蛇舌草治疗胃癌的机理。该研究挖掘剖析了半枝莲-白花蛇舌草的有效组分、作用靶点以及主要信号通路，最终从微观角度很好地阐述半枝莲-白花蛇舌草抑制以及治疗胃癌的机理。

1 技术与方法

1.1 构建药对化学组分数据库 基于化学专业数据库（http：//www.organchem.csdb.cn.）和系统药理学数据库（https：//tcmspw.com/tcmsp.php，TCMSP）两个专业性平台以及文献中检索挖掘获得半枝莲-白花蛇舌草中的活性化学成分并建立相应化学组分数据库[13]。

1.2 药效动力学筛选 选择药效动力学（ADME）模型进行预测，确定出药物化学组分的口服生物利用度（OB）与类药性（DL）[14]，并把满足 OB≥30%且 DL≥18%的有效成分作为候选化合物，另外通过文献检索筛选化学组分在满足DL≥18%的情况下，OB＜30%但具有较好活性的药物分子。两种方式筛选出的化学组分合并作为半枝莲-白花蛇舌草的有效化学组分。

1.3 靶点预测 该研究利用支持向量机（SVM）和随机森林（RF）算法[15]于 DrugBank数据库（https：//www.drugbank.ca/）挖掘预测基因靶点，并设置参数满足SVM≥0.7且RF≥0.8的基因靶点作为候选靶点。

1.4 蛋白质互作网络（Protein-Protein-Interaction，PPI）分析 将半枝莲-白花蛇舌草有效组分对应基因靶点的64个潜在作用靶点导入String数据库平台[16]，挖掘获得核心靶点，最后构建半枝莲-白花蛇舌草活性成分相应核心靶点的蛋白质互作关系网络。

1.5 分子对接 利用分子对接技术验证中药的活性组分与治疗靶点的交互作用是否可靠，研究有效组分与目标靶蛋白之间结合的方式与结合力。本研究采用AutoDock软件[17]将半枝莲-白花蛇舌草有效组分与目标靶点进行分子对接。后将半枝莲-白花蛇舌草有效组分对接到去掉原本配体的蛋白质靶标空腔里，对接完成后，选择打分最高的对接复合体保留作为最优的对接结合模式，然后利用自由能判定其有效组分与靶点的相关性。

1.6 富集分析 利用半枝莲-白花蛇舌草有效组分的靶点信息导入生物信息学数据库DAVID 6.8进行GO富集分析[18]，筛选出胃癌与半枝莲-白花蛇舌草有效成分相关程度较高的前5个分子的生物功能和相关通路。

1.7 分子网络构建 把通过数据挖掘获得的半枝莲-白花蛇舌草的有效组分，相应靶点及功能信息导入到Cytoscape3.7.2软件中[19]，在此基础上建立起相互作用网络、有效组分-目标靶点-分子生物功能网络，然后采用网络拓扑学参数分析网络中靶点相互作用关系[20]。

2 结果

2.1 有效组分筛选结果 该研究通过系统网络药理学的数据挖掘总共筛选出半枝莲-白花蛇舌草的35个有效成分，其中白花蛇舌草筛选出有效成分8个，半枝莲筛选出有效成分27个。本研究筛选有效组分是以满足参数OB≥30%，DL≥0.18作为筛选基础条件，另外以文献检索的方式收集了OB不满足以上条件但具有生物活性的药物分子，如Sitogluside，Ursolic Acid[21]等也列入半枝莲-白花蛇舌草有效组分数据集。同时在半枝莲的有效成分筛选结果中删除了与白花蛇舌草有效成分重复的成分。筛选出的半枝莲-白花蛇舌草有效组分都有CAS号与之对应以保证成分真实性（表1）。

表1 半枝莲-白花蛇舌草活性成分

2.2 分子-靶点网络分析 本研究将筛选后的35个半枝莲-白花蛇舌草有效组分与64个基因靶点导入到Cytoscape3.7.2[22]软件中作图以构建有效组分-基因靶点网络（图1）。其中雄激素受体（AR，carbonic anhydrase 2）、雌激素受体（ESR1，estrogen receptor）、碳酸酐酶 2（CA2，carbonic anhydrase 2）、非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶 1（PTPN1，Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 1）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（PIM1，proto-oncogene serine/threonine-protein kinase）、细胞分裂蛋白激酶 2（CDK2，cell division protein kinase 2）是与半枝莲-白花蛇舌草有效组分相关程度最高的6个靶点（表2）。

图1 有效组分-基因靶点网络

表2 半枝莲-白花蛇舌草有效组分对应的前15位靶点

2.3 PPI网络分析 64个基因靶点被导入String数据库平台后，得到了Color By Cluster，PPI Color By Cluster的PPI网络互作关系图，其中可见多个核心靶点互作关系（图2）。

图2 蛋白质-蛋白质互相作用网络

2.4 分子对接以及结合自由能分析 有效成分-基因靶点网络构建完成后，从网络互作关系中选择相关程度最高的6个基因靶点，另外再选择半枝莲和白花蛇舌草中相关程度最高有效成分各3个。分别把6个基因靶点与6个有效小分子格式转化后在AutoDock软件中进行对接。对接后各有效组分和基因靶点的结合模式表明，二者可紧密结合（图3、图4），对接后显示分子与基因靶点间的结合能力与结合自由能（表3），结果显示有效组分小分子与基因靶点间的结合能力比较强。表明半枝莲-白花蛇舌草有效成分小分子可以与相应基因靶点结合，也证实了所预测结果的准确性。

图3 活性成分-基因靶点分子对接的结合空腔

图4 活性成分-基因靶点分子对接的结合模式

表3 前6名靶点与有效组分间的结合自由能

2.5 GO富集分析 在此分析过程中将以上筛选出的有效组分与基因靶点数据导入DAVID6.8平台内，且设置物种为人源，对筛选结果进行处理，从而确定出相应靶点的分子功能。而后进一步处理作有效组分-靶点-GO分析的柱状图与气泡图（图5）。对分子功能进行对比，发现相关度最高的功能依次为神经递质受体活性（Neurotransmitter receptor activity）、G 蛋白偶联受体活性（G protein coupled receptor activity）、G蛋白偶联的神经递质受体活性（G protein-coupled neurotransmitter receptor activity）、突触后神经递质受体活性（postsynaptic neurotransmitter receptor ac－tivity）、G蛋白偶联的血清素受体活性（G proteincoupled serotonin receptor activity）。研究发现在细胞免疫、凋亡、炎性反应等过程中，这些分子功能都与之密切相关，且影响了胃癌的病理过程。

图5 有效组分-基因靶点-分子功能的GO富集分析

2.6 分子-靶点-功能网络分析 筛选出半枝莲-白花蛇舌草有效成分与对应的基因靶点后，利用筛选出的基因靶点于UniProt数据库中整理出靶点调控的生物功能。从而将有效组分、基因靶点、靶点调控功能导入Cytoscape3.7.2中作图（图6）并分析，利用网络拓扑学分析并得出结果，64个靶基因所调控的生物功能主要分为4类，包括细胞分化与转移、细胞周期、抗炎和机体防御功能。

图6 有效组分-基因靶点-调控功能网络

2.7 靶点-通路富集分析 将系统药理学数据库中挖掘得到的半枝莲-白花蛇舌草活性成分相应基因靶点映射到KEGG数据库，对数据进行统计分析从而确定出靶点相关通路。对信号通路的关联度进行排序，从而得到相关性最高的通路，依次为钙信号通路（Calcium signaling pathway，degree=17）、cGMP-PKG信号通路 （cGMP-PKG signaling pathway，degree=10）、雌激素信号通路（Estrogen signaling pathway，degree=10）、cAMP 信号通路（cAMP signaling pathway，degree=8）（图 7）。从而探讨半枝莲-白花蛇舌草治疗胃癌的作用机制。

图7 关键靶点的GO功能富集分析柱状图与气泡图

3 讨论

以现有的胃癌治疗来看，胃癌手术引发的各种副作用，易复发甚至造成死亡依然是全球的棘手课题。半枝莲为唇形科黄芩多年生草本植物，有清热解毒、活血化瘀等功效。白花蛇舌草为茜草科耳草属植物，有清热解毒、消肿利尿的功效。两者均有清热解毒之功效并均以全草入药，对治疗肿瘤、炎症有较好的疗效。两药配伍，相须为用，适于中医“七情和合”的组方原则，起到协同增效，清热解毒、化瘀抗癌的功效[23]。在临床运用中，半枝莲，白花蛇舌草常以药对形式出现于“肿瘤和方”“乙肝解毒汤”和“二半二白汤”等经典方中。现代药理学研究表明两药配伍亦用于治疗肝癌、胃癌、肺癌等肿瘤疾病[24]。半枝莲-白花蛇舌草常用于临床上治疗肿瘤，起到清热解毒以消痰火之壑遏与活血化瘀以消肿溃坚的作用[25]。半枝莲与白花蛇舌草经过不同比例的配比常用于临床上治疗胃癌、肝癌、肺癌等并取得较好的效果。大量的临床运用与经验表明半枝莲-白花蛇舌草用于治疗癌症、炎症等疗效明确且优于单味药的临床运用效果[26]。临床上，半枝莲-白花蛇舌草治疗癌症的运用虽然比较多，但通过国内外的文献研究发现对半枝莲-白花蛇舌草抑制或治疗胃癌的活性成分、相关的关键基因靶点、相关通路与生物途径的作用机制研究尚且比较少见[27]。

通过对半枝莲-白花蛇舌草的数据挖掘以及网络整合分析可知半枝莲-白花蛇舌草中含2-羟基-3-甲基蒽醌、菜油甾醇与槲皮素等多种活性成分。现有研究已经表明黄酮类[28]、甾醇类[29]、蒽醌类[30]、萜类[31]可治疗胃癌并具有较好疗效。例如活性分子槲皮素归属于黄酮一类，可抑制PI3K/Akt通路来诱导癌细胞发生凋亡[32]。另外，甾醇类化合物如β-谷甾醇等可扰乱细胞信号通路来达到抑制胃癌发展等[33]；蒽醌类可促进细胞凋亡并可调节下游蛋白家族的成员，最终也诱导细胞启动凋亡程序[34-37]。因此2-羟基-3-甲基蒽醌运用于多种肿瘤治疗[38]。以上结果表明本研究筛选活性成分的准确性，以及半枝莲-白花蛇舌草具有抗癌，抗炎与调节免疫等功能。

通过网络分析发现 PIM1、CDK2、MAPK14为主要的靶点，有可能是在胃癌治疗网络中的关键基因靶点。PIM1参与到多种肿瘤发展过程[39]，如PIM1相应基因无表达抑制了胃癌细胞增殖且促进其凋亡[40]。CDK2可以正向调节细胞的周期，并于某些恶性肿瘤中大量表达[41]。因此，半枝莲-白花蛇舌草可能通过抑制CDK2的过表达来降低胃癌的恶性率与增殖率。此外，高表达的MAPK14可抑制细胞凋亡[42]，半枝莲-白花蛇舌草可能通过抑制MAPK14的表达来对抗胃癌发展进程。

在系统药理学的数据挖掘与分析之后，筛选出与半枝莲-白花蛇舌草有效成分对应的基因靶点结合度最高的通路，分别为Calcium、cGMP-PKG与Estrogen信号通路。研究发现其中钙离子通路可调节胃癌的病理进程[43]；cGMP-PKG信号通路亦可以调节激活下游钙离子通路[44]，即半枝莲-白花蛇舌草有可能通过降低细胞内部钙离子浓度从而达到抑制胃癌的目的；在雌激素信号通路中，高浓度的雌激素起到减缓、抑制胃癌细胞生长、增殖的作用，反之促进其功能，表明半枝莲-白花蛇舌草可能影响雌激素信号通路表达最终促进胃癌细胞发生凋亡。

综上，已有研究表明半枝莲-白花蛇舌草可以有效抑制多种胃癌细胞增殖生长[45-48]，且已有报道其用于临床作为辅助治疗胃癌，可见明显效果且可靠安全[49-51]。由于其对胃癌治疗的具体机制研究尚不多见，因此本研究阐释了基于分子网络研究半枝莲-白花蛇舌草治疗胃癌的多尺度作用机制，为中药多途径、多靶点、协同作用机制方面的研究奠定了一定的理论基础，对半枝莲-白花蛇舌草运用于胃癌治疗提供一定的中医理论依据。