枸杞多糖对成骨细胞增殖及凋亡的影响研究

尹自飞，高 峰，吴晓峰，周 莉，徐 锋

（江苏省昆山市中医院，江苏 昆山 215300）

枸杞在我国已有几千年的药用历史，枸杞中的化学成分较为复杂，包括多糖类、生物碱、类胡萝素、黄酮类、微量元素、氨基酸、维生素等[1]。近年来，大量的实验药理学研究[2]表明，枸杞多糖是枸杞的主要生物活性成分，具有免疫调节、抗肿瘤等多种生物学作用。枸杞多糖对成骨细胞MG-63的影响，目前临床上少有报道，本研究探讨枸杞多糖对成骨细胞MG-63的增殖及凋亡的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株：成骨细胞MG-63购于中国科学院上海生命科学研究院资源中心。

1.1.2 主要试剂：MTT，购于Sigma公司；DMEM培养基，购于Sigma公司；FACSVerse流式细胞仪，美国BD公司产品；枸杞多糖，宁夏启元药业公司提供（含量50%）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞株培养：MG-63细胞株培养于含10%胎牛血清DMEM培养基，置培养箱内50% CO2、37 ℃培养，2 d换液一次，4～5 d传代1 次，细胞生长至瓶底约85%时进行实验。

1.2.2 实验分组：①对照组：不加入枸杞多糖。②实验组：培养基内加入枸杞多糖，浓度为10%。

1.2.3 细胞增殖效应：将细胞以5×104个/孔接种于96孔板，培养24 h，对照组给予常规培养3 d，实验组在对照组基础上给予10%枸杞多糖培养3 d，并于培养当日和培养1、3 d后每孔加10 μL浓度为5 g/L的MTT孵育4 h，每孔加100 μL的DMSO，震荡10 min，酶标仪检测490 nm波长吸光度。

1.2.4 细胞凋亡效应：取对照组和实验组细胞，用0.25%胰酶消化后制备细胞悬液，调整细胞数量为每管1×105个细胞，加入1× 500 Binding Buffer 500 μL，再加入Annexin Ⅴ-FITC 5 μL和PI 10 μL，混匀液体后避光30 min，在1 h 内上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.3 统计学分析 应用SPSS 22.0统计软件进行分析。计量资料以（±s）表示，组间比较用单因素方差分析，两两比较用LSD检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 枸杞多糖对成骨细胞MG-63增殖的影响 与对照组相比，枸杞多糖对MG-63细胞的增殖具有促进作用，差异有统计学意义（P＜0.05）。（表1）

表1 对照组与实验组细胞增殖实验比较（±s）

表1 对照组与实验组细胞增殖实验比较（±s）

组别 n OD值对照组 10 0.73±0.03实验组 10 0.81±0.04 F-1.02 P 0.03

2.2 枸杞多糖对成骨细胞MG-63凋亡的影响 与对照组相比，枸杞多糖减少MG-63细胞的凋亡，差异有统计学意义（P＜0.05）。（表2）

表2 对照组与实验组细胞凋亡实验比较（±s）

表2 对照组与实验组细胞凋亡实验比较（±s）

项目 对照组（n＝10）实验组（n＝10） t P G0/G1（%） 50.2±7.8 58.1±6.5 -2.46 0.01 S（%） 17.3±1.3 18.9±0.8 -3.31 0.001 G2/M（%） 30.7±1.8 33.7±2.2 -3.33 0.002细胞凋亡率（%） 3.9±0.3 3.4±0.5 2.71 0.007

3 讨论

大量研究[3]证实，骨骼的正常生长是由成骨细胞与破骨细胞的细胞功能共同维持的骨代谢动态平衡所决定，成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，其增殖活性是成骨的关键，负责骨基质的合成、分泌和矿化。破骨细胞行使骨吸收的功能，与成骨细胞在功能上相对应，二者协同。当骨质出现病理性改变时，会使成骨细胞凋亡增加、破骨细胞凋亡减少，导致骨形成平衡破坏而使骨化减弱，导致骨微结构损害和骨密度、骨质量下降，最终导致骨折的发生[4]。MG-63成骨细胞由于其稳定的表型可被认为是合适的体外细胞模型。

枸杞多糖具有多种生物活性，是近年来研究的热点问题[5]。最新的研究[6]证实：枸杞多糖通过抑制Shh信号通路阻滞骨肉瘤HOS细胞周期、抑制细胞增殖并促进细胞凋亡。张炜等[7]研究证实枸杞多糖对未成熟树突状细胞DC2.4有促进其增殖作用。马锋等[8]研究证实枸杞多糖具有促进MC3T3-E1成骨细胞增殖及矿化作用。黄汀等[9]通过研究证实枸杞多糖对膀胱癌细胞T-24有抑制其增殖、促进凋亡的作用。本研究通过MTT法证实实验组在490 nm波长处吸光值高于对照组，枸杞多糖具有促进MG-63成骨细胞增殖作用，差异具有统计学意义（P＜0.05）。细胞周期是指细胞从一次分裂结束开始生长，到下一次分裂结束所经历的过程。整个细胞周期是一个动态过程，每个分期互相联系，不可分割。细胞凋亡是细胞维持生命活动的重要过程，对器官组织的生长发育、免疫、新陈代谢以及非正常细胞的清除具有重要意义。闫梅等[10]通过流式细胞术检测发现枸杞多糖对视网膜色素上皮细胞凋亡具有抑制作用。本次流式细胞术检测结果表明，枸杞多糖具有抑制MG-63成骨细胞的凋亡作用。

综上，本实验证实枸杞多糖能够促进MG-63成骨细胞的增殖，抑制其凋亡。为枸杞多糖的进一步临床应用提供了理论依据。