簕菜根中质量标志物的初步预测及分析
2021-06-10周媛郭勇秀蒋林李芳婵随家宁魏博伟
周媛，郭勇秀，蒋林, *，李芳婵，随家宁，魏博伟
1. 广西农业职业技术学院（南宁 530007）；2. 广西中医药大学药学院（南宁 530007）；3. 广西中医药大学广西壮瑶药工程技术研究中心（南宁 530007）
簕菜根是五加科植物白簕（Acanthopanax trifoliatus（L.）Merr.）的干燥根皮，收录在广西壮族自治区壮药质量标准（第一卷）。簕菜根味苦，辛，凉，具有清热解毒、祛风利湿、舒筋活血功效[1]。簕菜根在民间用于治疗感冒高热、风湿/类风湿性关节炎等。有研究结果表明簕菜根的醇提物具有明显的抗炎镇痛作用[2-3]，现代药理作用研究提示与其清热解毒、祛风除湿功效有良好的相关性；同时，五加属酚酸类成分具有多种功效，如抗氧化、抗病毒、抗炎症、抑菌等，其中抗炎作用尤为突出[4-8]。目前从簕菜根提取分离出来的成分主要有绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C等[9]酚酸类成分。研究报道，簕菜根及其同属植物中主要有酚酸类、木质素类、挥发油类、萜类等成分[10]。其中酚酸类成分是五加属植物的重要特征化学标志物。因此，从同属之间的亲缘关系及簕菜不同药用部位分析，酚酸类是其主要化学成分之一，多数共有成分为新绿原酸、绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、咖啡酸、原儿茶酸等，可考虑作为簕菜根药材的特征化学标志物。此次试验根据近年来对簕菜根及其同属植物的研究，依照质量标志物（Q-marker）的新概念和新理论[11]，初步预测簕菜根潜在的Q-marker并测定含量，为簕菜根开发成保健食品及临床用药质量控制提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验仪器与材料
1.1.1 仪器与设备
Shimadzu LC-2030 Plus高效液相色谱系统（日本岛津公司）；色谱柱phenomenex C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；Mettler Toledo XS105DU电子分析天平；KQ5200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；密理博超纯水机（广西南宁市博美生物科技有限公司）。
1.1.2 试剂与材料
对照品绿原酸（批号110753-201817，纯度≥96.8%，购自中国食品药品检定研究院）；异绿原酸B（批号 DST190226-037，纯度≥99.04%）；异绿原酸A（DST190113-036，纯度≥99.5%）；异绿原酸C（DST190110-038，纯度≥99.47%，购自成都德思特生物技术有限公司）。乙腈、甲醇为色谱纯，其余为分析纯，水为超纯水。
10批簕菜根分别购自桂林、钦州、南宁、防城港、金秀、阳朔、乐山、揭阳、赣州、汕头，经广西中医药大学朱意麟高级实验师鉴定，均为五加科植物白簕（Acanthopanax trifoliatus（L.）Merr.）的干燥根。
1.2 试验方法
1.2.1 色谱条件
色谱柱Phenomenex C18（4.6 nm×250 nm×5 μm）；流动相：乙腈（C）-0.2%磷酸溶液（A），梯度洗脱（0～6 min，9.5% C；6～15 min，13% C；15～18 min，14%；18～20 min，15% C；20～30 min，18%C；30～45 min，30% C；45～50 min，35% C）；流速：1 mL/min；检测波长：325 nm；柱温：30 ℃；进样量：5 μL。
1.2.2 混合对照品溶液的制备
分别精密称取适量新绿原酸、绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C对照品，加50%甲醇溶解，分别制成质量浓度为1.03，1.55，1.16，1.01和1.21 mg/mL的对照品溶液；另取适量上述溶液，置于同一量瓶中，加50%甲醇稀释，制成含新绿原酸、绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C质量浓度分别为0.019，0.39，0.2，0.033和0.06 mg/mL的混合对照品溶液，备用。
1.2.3 供试品溶液的制备
精密称取约0.5 g簕菜根粉末，置于50 mL具塞锥形瓶中，精密加入30 mL 50%乙醇，称其质量，超声30 min，冷却，加50%乙醇补足减失质量，过滤，取15 mL续滤液，挥干，用50%乙醇定容至5 mL，摇匀，过滤，取续滤液离心，取上清液，即得。
1.3 方法学考察
1.3.1 线性关系考察取混合对照品溶液，进样测定，绘制标准曲线，得出回归方程及线性范围。
1.3.2 专属性考察取混合对照品溶液和供试品溶液进行HPLC检测并分析其专属性。
1.3.3 精密度考察取混合对照溶液，连续进样6次，测定峰面积计算相对标准偏差（δRSD），检验HPLC的精密度。
1.3.4 重复性考察
取供试品粉末，精密称定，平行制备6份供试品溶液，进样测定，计算5个成分的含量及δRSD，检验HPLC的重复性。
1.3.5 稳定性考察
取供试品溶液，进样测定，根据新绿原酸、绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A及异绿原酸C 5个成分峰面积，分别计算δRSD，检验HPLC的稳定性。
1.3.6 加样回收率考察
取同一批已知含量簕菜根样品粉末，精密称定6份，每份约0.25 g，分别精密加入一定量的新绿原酸、绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C对照品，制备供试品溶液，进行测定，计算回收率及δRSD。
1.4 样品含量测定
分别精密称取0.5 g 10个产地样品粉末，制备供试品溶液，测定峰面积。根据回归方程计算10批样品中5个酚酸类成分含量，拟定含量限定范围。
2 结果与分析
2.1 方法学考察结果
2.1.1 线性关系考察结果
由表1可知，新绿原酸、绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C分别在0.019～0.380，0.390～7.800，0.033～0.660，0.200～4.000和0.060～1.200 mg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。
表1 新绿原酸、绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C线性回归方程及线性范围
2.1.2 专属性考察结果
由图1可知，混合对照品溶液及簕菜根供试品溶液中5个酚酸类成分分离度良好。
图1 混合对照品（A）和簕菜根样品（B）的HPLC 色谱图
2.1.3 精密度考察结果
结果显示，新绿原酸、绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A及异绿原酸C峰面积δRSD分别为0.05%，0.07%，0.39%，0.06%和0.75%，表明建立的HPLC精密度良好。
2.1.4 重复性考察结果
结果显示，新绿原酸、绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A及异绿原酸C平均含量分别为1.038，16.32，1.843，17.36和5.519 mg/g，其δRSD分别为1.10%，2.40%，2.10%，2.40%和2.40%，表明建立的HPLC重复性良好。
2.1.5 稳定性考察结果
结果显示，新绿原酸、绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A及异绿原酸C峰面积δRSD分别为0.90%，0.22%，1.20%，0.39%和1.30%，表明该供试品在12 h内稳定性良好。
2.1.6 加样回收率考察结果
结果显示，新绿原酸、绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C的平均回收率分别为100%，105%，98%，103%和104%；其δRSD分别为2.32%，2.24%，1.90%，1.07%和1.43%，结果表明建立的HPLC回收率试验符合要求。
2.2 含量测定结果
由表2可知，10个不同产地簕菜根的5种酚酸类成分均有检出，结果表明不同产地之间含量存在差异。绿原酸的含量变化范围为6.567～78.88 mg/g，以广西南宁的含量最高（78.88 mg/g），四川乐山的含量最低（6.567 mg/g）；异绿原酸A的含量变化范围为6.289～25.56 mg/g，含量最高的是江西赣州（25.56 mg/g），最低的是广西钦州（6.289 mg/g）；异绿原酸C的含量变化范围为1.012～12.08 mg/g，含量最高的是四川乐山（12.08 mg/g），最低的是广西桂林（1.012 mg/g）；异绿原酸B的含量变化范围为1.330～4.488 mg/g，含量最高的是广西南宁（4.488 mg/g），最低的是广西阳（1.330 mg/g）；新绿原酸的含量变化范围为0.682～1.409 mg/g，含量最高的是广西金秀（1.409 mg/g），最低的是江西赣州（0.682 mg/g）。其中，广西南宁簕菜根的绿原酸、异绿原酸B含量普遍高于广西其他产地、广东揭阳、广东汕头、四川乐山和江西赣州。
表2 10批次簕菜根含量测定结果 单位：mg/g
3 讨论
簕菜根是广西特色的民间常用药，目前对食用嫩茎叶研究较多，其根尚未开展深入系统研究，所以其资源也未能得到有效利用。前期课题组采用高效液相色谱与Q-Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用，考察不同产地的簕菜根成分，借助赛默飞中药成分高分辨质谱数据库OTCML分析，初步推断簕菜根中含有酚酸类成分绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C，并因产地不同有差异。通过测定10个产地簕菜根的含量，结果显示10个产地的簕菜根均含有新绿原酸、绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C这5种酚酸类成分。此次试验是结合Q-marker理论，对簕菜根药材的主要活性成分进行研究，根据簕菜根化学成分的特有性及有效性进行分析，对簕菜根的Q-marker进行预测与含量分析，建立HPLC法同时测定簕菜根壮药材中新绿原酸、绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C的含量，从而证明簕菜根药材选择酚酸类成分作为质量标志物之一有一定的合理性与科学性。
基于单一指标成分难以全面反映簕菜根的质量，因此选择多指标成分进行质量分析，采用HPLC同时用于测定簕菜根中5个酚酸类成分的含量，建立簕菜根的质量标准。该方法操作简单、精密度高、重复性好，为合理评价簕菜根在保健食品及临床用药质量提供科学依据。
4 结论
此次试验仅对簕菜根酚酸类成分开展初步研究，簕菜根含有的木质素类、多糖类、黄酮类及萜类等成分，也具有抗炎镇痛药理作用[12-13]，很有必要对其进行深入研究，建立专属的测定方法。后期，课题组将基于Q-marker理论及研究模式，对簕菜根进行深入研究，确定簕菜根的Q-marker，建立科学可行的质量分析和评价方法，为中药质量标志物在开发保健食品中的应用提供新的研究思路。
