酶解豆清液制备抗氧化肽

尹乐斌 *，刘丹，廖聪，杨爱莲，何平

1. 邵阳学院食品与化学工程学院（邵阳 422000）；2. 邵阳学院豆制品加工与安全控制湖南省重点实验室（邵阳 422000）

豆清液是豆制品生产过程中的副产物，每加工处理1 t大豆将产生2～5 t豆清液，且豆清液富含氨基酸、异黄酮以及低聚糖等营养成分。大豆多肽是大豆蛋白的水解产物，具有降血压、抗氧化、抗疲劳等[1-4]优点，在食品、医药等行业具有良好的发展前景[5]，且与大豆蛋白相比，大豆多肽的相对分子量较小，更容易被吸收利用。利用豆清液作为多肽产品的原材料可以减少豆清液的浪费，同时也能为企业增添经济效益。

抗氧化肽是指具有抗氧化活性的肽类物质，在维持机体自由基平衡，提高机体抗衰老能力与抵抗疾病等方面具有重要的作用[6]，利用酶水解蛋白质可获得具有良好抗氧化活性的多肽，是当前研究热点之一[7-9]。胃蛋白酶是专一性较强的蛋白酶，具有一定的氨基酸序列选择特异性，优先断裂由芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸）或亮氨酸形成的肽键[10]。有研究表明胃蛋白酶水解蛋白（如米糠蛋白、苦荞球蛋白、芝麻蛋白等）可获得具有抗氧化性的水解物[11-14]；Zhang等[15-16]利用碱性蛋白酶酶解得到大豆水解液对DPPH自由基具有较高的清除率，利用所得抗氧化肽评估合成肽对氧化的细胞保护作用人肠道Caco-2细胞的应激反应。但胃蛋白酶水解豆清液制备豆清多肽及其对抗氧化活性研究仍鲜见报道。通过对胃蛋白酶水解豆清液生产多肽的探索研究，旨在为豆清液的再利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

722型可见分光光度计（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；VELOCITY 14R台式冷冻离心机（Dynamica Scientific Ltd.）；SCIENTZ-18N冷冻干燥机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

豆清液（学校果蔬清洁加工实验室提供）；胃蛋白酶（河北格贝达生物科技有限公司）；2, 2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS，上海如吉生物科技发展公司）；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（Shanghai Chemical Industy Park）。

1.2 试验方法

1.2.1 酶解液的制备

称取一定量的豆清液，调节pH，加入胃蛋白酶酶解数小时。酶解结束后取出，于沸水中灭酶10 min，室温冷却，在4 000 r/min条件下离心10 min，收集上清液进行测定。此上清液即为多肽上清液。

1.2.2 多肽质量浓度的测定

多肽质量浓度的测定参照文献[17]并稍作改动。将豆清液和豆清原液与10%三氯乙酸（TCA）溶液以体积比1︰1加入至2 mL离心管中，静置10 min，在7 000 r/min下离心15 min。取1 mL上清液加水稀释至6 mL，加入4 mL双缩脲溶液，摇匀，静置30 min后，在540 nm处测定吸光度，用牛血清标准蛋白标准曲线算出多肽质量浓度。按式（1）计算多肽产率。

式中：D为多肽产率，%；h1为酶解后多肽质量浓度，mg/mL；h2为酶解前多肽质量浓度，mg/mL。

1.2.3 抗氧化活性测定

将在最佳工艺条件酶解过的豆清液用真空冷冻干燥机干燥24 h至固体状的豆清多肽样品和VC稀释成不同浓度待测液。ABTS自由基清除率测定参考文献[18]的方法；DPPH自由基清除率测定参考文献[19]的方法。

1.2.4 单因素试验

测定胃蛋白酶在不同条件下，即酶解时间（4，5，6，7和8 h）、酶与底物浓度比（0.5，0.6，0.7，0.8和0.9 g/mL）、初始pH（4.5，4.0，3.5，3.0，2.5和2.0）和酶解温度（27，32，37，42，47和52 ℃）对水解豆清液的影响。

1.2.5 响应面试验

在单因素基础上，以多肽产率为指标应用响应面分析法中Box-Behnken的试验设计原理优化出最佳工艺参数。

表1 胃蛋白酶酶解产豆清多肽的响应面试验

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 酶解时间对胃蛋白酶酶解产豆清多肽产率的影响随着时间延长，多肽产率先逐渐加大到达峰值再逐渐减小，曲线整体呈现开口向下抛物线趋势。出现这种趋势可能是因为随着水解的进行，底物浓度下降，多肽质量浓度增加，多肽与蛋白质出现竞争性抑制作用。而酶活力可能随着温度或体系pH改变而降低，出现水解剩余底物能力减弱，或者不具有水解能力[20]。在整个时间段内，多肽产率最大为64.85%，出现在第6小时和第7小时；最小多肽产率为50.63%，出现在第8小时（见图1）。选用胃蛋白酶水解豆清液的时间为5，6和7 h进行响应面优化。

图1 酶解时间对胃蛋白酶酶解产豆清多肽产率的影响

2.1.2 酶与底物浓度比对胃蛋白酶酶解产豆清多肽产率的影响

酶与底物浓度比对多肽产率的影响如图2所示。随着浓度比增长，多肽产率先逐渐加大到达峰值再逐渐减小，曲线整体呈现开口向下抛物线趋势。曲线预期趋势是先上升后趋于平缓，呈现抛物线的原因可能是随着酶与底物浓度比增多，酶之间出现竞争性抑制或酶自身相互水解，导致酶活力降低。在5个浓度梯度中，多肽产率最大为32.14%，出现在0.7 g/mL；最小多肽产率为25.2%，出现在0.9 g/mL。选用胃蛋白酶水解豆清液的酶与底物浓度比0.6，0.7和0.8 g/mL进行响应面优化。

图2 酶与底物浓度比对胃蛋白酶酶解产豆清多肽产率的影响

2.1.3 pH对胃蛋白酶酶解产豆清多肽产率的影响

随着pH增长，多肽产率先逐渐加大到达峰值再逐渐减小，曲线整体呈现开口向下抛物线趋势，这是因为胃蛋白酶是一种酸性酶且有最适pH，在酸性条件下有较高活性并在最佳酸性条件下活性最高（见图3）。酶解底物的带电状态会因pH变化而改变。底物是蛋白质、肽或氨基酸等两性电解质时，随着pH改变底物呈现不同解离状态，酶的活力部位往往只能作用于底物的一种解离状态，且酶分子的带电状态也会随着pH发生变化[20]。6个pH梯度中，多肽产率最大为14.54%，出现在pH 4.00；最小多肽产率为8.39%，出现在pH 2.0。选用初始pH 3.5，4.0和4.5进行响应面优化。

2.1.4 温度对胃蛋白酶酶解产豆清多肽产率的影响

随着温度的增长，多肽产率先逐渐加大到达峰值再逐渐减小，曲线整体呈现开口向下抛物线趋势，蛋白酶作为一种蛋白质类生物催化剂，受温度影响较大，在一定温度范围内，催化反应的速率随着温度上升而上升，但是超过一定温度催化活性反而降低。6个温度梯度中，多肽产率最大为79.44%，出现在温度32 ℃；最小多肽产率为62.47%，出现在52 ℃（见图4）。选用酶解温度27，32和37 ℃进行响应面优化。

图3 pH对胃蛋白酶酶解产豆清多肽产率的影响

图4 温度对胃蛋白酶酶解产豆清多肽产率的影响

2.2 响应面优化试验

2.2.1 响应面结果（表2）

2.2.2 模型建立及显著性分析

利用软件Design-Expert Version 8.0.6.1可以得到回归方程和方差分析表格，见表3。

从表3看到，该多肽产率模型（模型项F值有0.38%的可能是由于干扰）回归高度显著（0.000 1≤p＜0.01），失拟项F值（有21.90%的可能性是由于干扰）为2.30意味着相对于纯误差而言，失拟项并不显著，且R2=0.819 8，R2adj=0.639 6，因此可以用来预测胃蛋白酶水解豆清液生产大豆多肽的工艺。各个因素影响的大小顺序为酶解温度＞酶解pH＞酶与底物浓度比＞酶解时间。D2项p＜0.000 1说明D2项偏回归系数差异极显著。

表2 胃蛋白酶酶解产豆清多肽的响应面试验结果

表3 胃蛋白酶酶解产豆清多肽产率方差分析

2.2.3 最佳工艺条件的确定

使用Design-Expert Version 8.0.6.1软件，得出胃蛋白酶水解豆清液生产大豆多肽的最佳工艺条件为酶解时间7 h、酶与底物浓度比0.8 g/mL、初始pH 3.5、酶解温度31.33 ℃。使用该工艺条件，预期大豆多肽产率为39.13%。考虑实际操作，选择酶解时间7 h、酶与底物浓度比0.8 g/mL、初始pH 3.5、酶解温度31℃。经验证试验得大豆多肽产率为40.08%，与预测值相比无显著差异，说明通过Design-Expert Version 8.0.6.1软件分析得到的最佳工艺条件可行。

2.3 抗氧化活性研究试验

2.3.1 ABTS自由基清除率测定

豆清液酶解物对ABTS自由基均有较强的清除能力，但豆清液酶解物清除能力要弱于VC。在抗氧化试验所测定范围内，豆清液酶解物和VC对ABTS自由基清除率均随自身浓度增大而增强，且VC溶液在0.016 mg/mL时对ABTS自由基清除率达到最大100%，豆清液酶解物在0～0.05 g/mL的浓度范围内，对ABTS自由基清除率最大达到100%（见图5）。

图5 VC和豆清酶解物对ABTS自由基清除率的影响

2.3.2 DPPH自由基清除率测定

豆清酶解物对DPPH自由基清除能力较强，但豆清液酶解物清除能力要弱于VC。在抗氧化试验所测定范围内，豆清酶解物和VC对DPPH自由基清除率均随自身浓度增大而增强，且VC 0.032 mg/mL时对DPPH自由基清除率达到最大95.6%，豆清酶解物0.05 g/mL时对DPPH自由基清除率达到最大98.8%（见图6）。在试验测定的范围外，即VC质量浓度大于0.032 mg/mL和豆清酶解物浓度大于0.05 g/mL，2种样品对DPPH自由基清除率会继续增大并最终达到100%。

图6 VC和豆清酶解物对DPPH自由基清除率的影响

3 结论

在单因素试验基础上，根据Box-Behnken原理，利用Design-Export Version 8.0.6.1软件建立以豆清多肽产率为指标的二次多项式回归模型，用响应面法优化胃蛋白酶酶解制备豆清多肽的工艺。结果表明，最优工艺条件为酶解最优条件为时间7 h，酶与豆清液浓度比0.8 g/mL、初始pH 3.5、酶解温度31 ℃，在此条件下多肽产率为40.08%；抗氧化试验中，豆清多肽对ABTS自由基的清除率最大可达100%，对DPPH自由基的清除率最大可达98.8%。结果表明胃蛋白酶酶解豆清液制备的豆清多肽具有较好的抗氧化性，可作为优质抗氧化肽的良好来源，还需深入探究豆清多肽的结构和性质。胃蛋白酶酶解可有效提高豆清多肽产率，可为豆清多肽的制备和推广应用提供理论依据，有利于豆清液的再利用。