碱水解法提取酸浆宿萼结合酚工艺优化
2021-06-10李成华薛长松于斌张伟豪
李成华，薛长松*，于斌，张伟豪
通化师范学院 吉林省重点实验室-长白山植物种质资源保护与利用实验室（通化 134001）
酸浆（Physali alkekengiL.）别名红姑娘、灯笼草、菇蔫儿、姑娘儿、挂金灯，原产于中国，主要分布在吉林、辽宁、黑龙江、内蒙古、四川、西藏等地，植株全身均可入药[1]，其性味甘、酸，性寒，有清凉、消肿、利尿、清除自由基、抗肿瘤等功效。初步研究发现，酸浆入药部位主要含黄酮、多酚类物质[2]。植物中存在的酚类化合物可分为游离酚和结合酚。酚类化合物的分离提取的难易程度与其存在形态有关，游离酚易溶于水或有机溶剂，可直接萃取出来，结合酚需要水解破坏化学键后或水解、蒸煮等方式破坏细胞结构才可提取[3-4]。结合酚广泛分布在植物中，具有较强抗氧化活性[5]，体内研究表明，在代谢途径和生物活性方面与游离酚相比有所不同[6]。结合酚经过胃和小肠消化，经肠道微生物菌群发酵作用后，相对于游离酚，在结肠中释放并产生更强生物活性[7-9]。开展植物结合酚提取方法的研究十分必要。Wang等[10]研究表明在水果中结合酚占比60%～90%，Ma等[11]研究表明枣籽中结合酚含量是游离酚的3倍以上，结合酚的水解方法主要为碱水解和酸水解，碱水解主要破坏酯键，酸水解主要破坏糖苷键[12]，以碱法最为常用，可避免高温损失结合酚。
酸浆宿萼结合酚提取工艺参数缺乏，以酸浆宿萼为原料，采用碱水解法将结合酚从原料组织中释放出来，采用乙酸乙酯进行萃取，利用响应面法优化结合酚的碱水解法提取工艺。开展该研究有利于开展酸浆宿萼中结合酚的提取及明确其含量，对评估酸浆宿萼结合酚的总量的研究具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料、仪器、试剂
酸浆宿萼（2017年10月采自吉林省通化市周边山上，粉碎备用）。
没食子酸对照品（批号161171-160921，中国食品药品检定研究院）；乙醇、乙酸乙酯、甲醇等（均为分析纯，天津市百世化工有限公司）。
HZQ-X100恒温振荡培养箱（大仓市实验设备厂）；HH-8型恒温水浴锅（常州冠军仪器制造有限公司）；RE-52AA旋转蒸发器（上海亚荣）；PB-10型pH计（北京赛多利斯科学仪器有限公司）等。
1.2 方法
1.2.1 原料处理及游离酚提取[13]
取1 g酸浆宿萼干燥粉末加25 mL体积分数80%丙酮，在50 ℃、100 W条件下超声处理30 min，过滤保留上清液，残渣用同样方法提取2次，合并上清液，定容至5 mL，得酸浆宿萼游离酚。
1.2.2 宿萼结合酚提取[14]
取充分提取游离酚后的宿萼残渣置于圆底烧瓶中，加入NaOH溶液后水解，离心（4 000 r/min，20min），弃去残渣保留上清液，用盐酸将pH调至中性后加入20 mL乙酸乙酯萃取，萃取2次，合并萃取相，离心（4 000 r/min，20 min）。在45 ℃条件下旋转蒸发至干，残余物用50%甲醇定容至5 mL，得到宿萼结合酚提取液，于-20 ℃避光保存。
1.2.3 多酚含量测定
1.2.3.1 标准曲线的绘制
准确称取10.00 mg没食子酸用蒸馏水定容至10mL，得到Ⅰ标准液，取2.5 mL Ⅰ标准液用蒸馏水定容至25 mL得到Ⅱ标准液。准确吸取0，1，2，3，4和5 mL的Ⅱ标准液，0.75，1.00和1.50 mL的Ⅰ标准液，用蒸馏水定容至5 mL，得到质量浓度梯度为0，20，40，60，80，100，150，200和300 μg/mL的标准使用液。
分别取125 μL标准使用液于试管中，加500 μL蒸馏水和125 μL福林酚，摇匀，反应6 min，加1.25 mL质量分数7% Na2CO3溶液，加入1 mL蒸馏水，在20 ℃下避光放置1.5 h后，在760 nm波长处测定吸光度，重复3次。根据测定结果绘制标准曲线，得回归方程Y=4.936X-0.022 1（R2=0.999 0）。
1.2.3.2 样品多酚质量分数测定
根据1.2.3.1的方法测定酸浆宿萼结合酚含量，多酚含量以每克质量中含没食子酸当量表示。
式中：C为测定的结合酚质量浓度，mg/mL；V为提取液总体积，μL；W为称取酸浆宿萼质量，g。
1.2.4 响应面法优化宿萼结合酚提取条件
在单因素试验的基础上，选择NaOH浓度（A）、液料比（B）、水解时间（C）、水解温度（D），利用Design-Expert 8.0.6软件优化酸浆宿萼结合酚提取条件。以结合酚提取量为响应值（Y）进行试验设计，各因素水平见表1。
表1 因素水平设计表
2 结果与分析
2.1 单因素考察结果
2.1.1 NaOH浓度对结合酚的影响
固定液料比30︰1（mL/g）、温度60 ℃、水解时间6 h，改变NaOH浓度（2，4，6，8和10 mol/L），结合酚提取量随NaOH浓度变化结果见图1。结合酚提取量从NaOH浓度2 mol/L开始随浓度增大而增大，NaOH浓度6 mol/L时结合酚提取量达到最高峰，随后开始下降又升高，因此，选择NaOH浓度6 mol/L时较适宜。一定浓度碱液能够水解结合酚的醚键和酯键，有利于结合酚释放，但是强碱环境中结合酚的羟基发生电离，造成结合酚损失[15]。
图1 NaOH浓度对结合酚含量的影响
2.1.2 液料比对结合酚的影响
固定NaOH浓度6 mol/L、温度60 ℃、水解时间6 h，改变液料比10︰1，20︰1，30︰1，40︰1和50︰1（mL/g），结合酚含量30︰1（mL/g）时达到最大值，见图2。可能是适当浓度碱液能破坏结合酚的结合键，增加溶剂用量促进结合酚的溶出[16]，故选择液料比30︰1（mL/g）。
图2 液料比对结合酚含量的影响
2.1.3 水解时间对结合酚的影响
固定NaOH浓度6 mol/L、液料比30︰1（mL/g）、温度60 ℃，改变水解时间2，4，6，8和10 h，随着提取时间延长，结合酚得率逐渐降低后升高，见图3。这可能是由于提取时间过长，会使部分结合酚被氧化，杂质大量溶出[15]。故选取提取时间为2 h。
图3 水解时间对结合酚含量的影响
2.1.4 水解温度对结合酚的影响
固定NaOH浓度6 mol/L、液料比30︰1（mL/g）、水解时间2 h，改变水解温度40，50，60，70和80℃，随着水解温度提高，结合酚含量呈上升趋势，在80 ℃达到最大，故选择水解温度80 ℃。
图4 水解温度对结合酚含量的影响
2.2 响应面法优化酸浆宿萼结合酚提取工艺试验结果
采用响应面分析法分析试验结果，以结合酚提取量为响应值，对试验数据进行二次多项式回归拟合，得回归方程：Y=21.53-0.55A+0.43B-1.06C+1.70D+2.30AB+0.95AC+1.41AD-1.18BC+0.44BD-1.92CD。试验设计方案与结果见表2。
表2 拟合设计试验方案及结果
由表3可知，以结合酚提取量为响应值，回归方程显著性检测p=0.026 3＜0.050，表明该二次方程模型显著，回归方程模型与实际拟合性较好，试验误差小，证明应用响应面法优化酸浆宿萼结合酚提取工艺可行，各因素对结合酚提取量的影响依次为水解时间＞液料比＞NaOH浓度＞提取温度。
表3 响应面法对酸浆宿萼结合酚提取量的方差分析表
将表2中的试验数据进行响应面曲面分析，选择2个交互的因素对结合酚提取量的影响进行分析。根据回归方程，考察拟合响应面的形状，分析水解时间、液料比、NaOH浓度、提取温度对结合酚提取量的影响，结果见图5。
利用回归方程分析结果绘制结合酚提取量随各因素变化的响应曲面图，由响应曲面图可知液料比、NaOH浓度、提取温度、水解时间对结合酚提取量的影响。由图5可见，提取条件在一定范围内，与其他提取因素比较，液料比与NaOH浓度交互因素与结合酚提取量呈明显的抛物线关系；随着液料比增加，结合酚提取量逐渐缓慢减少；随着NaOH浓度增加，结合酚提取量产量逐渐减少。
2.2.1 验证试验
由Design-Expert 8.0.6软件分析，得出酸浆宿萼结合酚提取的最优条件。结果显示，酸浆宿萼结合酚提取的最佳条件是液料比30︰1（mL/g）、NaOH浓度6 mol/L、水解时间2 h、提取温度80 ℃。结合酚提取量为20.169 mg/g。在此优化条件下，进行3次平行试验验证，结果显示，酸浆宿萼结合酚提取量为（20.13±0.18）mg/g，与模型预期值的误差为5.24%，说明方程与试验情况拟合较好。
图5 各两因素交互作用对结合酚提取影响的响应图
3 结论与讨论
采用响应面法优化碱水解法提取酸浆宿萼结合酚的工艺，最佳提取工艺条件为液料比30︰1 mL/g、NaOH浓度6 mol/L、水解时间2 h、提取温度80 ℃。在此条件下，酸浆结合酚提取量为（20.13±0.18）mg/g，与模型预期值的误差为5.24%，影响酸浆宿萼结合酚得率大小的因素主次顺序为水解时间＞液料比＞NaOH浓度＞提取温度。其中，液料比与NaOH浓度交互因素与结合酚提取量之间交互作用显著。
结合酚广泛存在于植物基质中，与游离酚相似，如樱桃[17]、茭白[18]等的结合酚。富含酚类化合物的食品进入消化道，游离酚可在小肠内酯酶的作用下水解，随后被吸收利用；与细胞壁紧密结合的酚类化合物在小肠水解的少，在结肠微生物产生的水解酶作用下缓慢持续地释放，可能会使其在体内发挥更长抗氧化作用[19]。游离态和结合态酚类化合物广泛分布在植物中，不同存在形态的酚类化合物具有相似的生物活性，不同的生理活性。不同酚类化合物在体内的吸收代谢途径和抗氧化方式不同，结合酚在体内较为持续的抗氧化作用及潜在的生理活性值得探究。研究结果为酸浆宿萼作为保健食品的深入开发及酸浆宿萼结合酚开发和利用提供依据，避免资源浪费。
