水解度对牡蛎酶解产物功能特性和抗氧化活性的影响

杨昭，黄佳佳，姚玉静*，曾琳琦，凌叶婷

广东食品药品职业学院食品学院（广州 510520）

牡蛎（oyster）是一种低脂肪高蛋白的水产品，含有丰富的蛋白质（45%～57%）、牛磺酸（50.6 mg/g）、总糖（18%～39%）和微量元素（硒、锌）等，拥有极高的营养价值和保健价值[1]。近十年来，我国牡蛎养殖产量逐年增加，年产量超过400万 t[2]。鉴于牡蛎具有较高的营养价值和较大的产量，蛋白质酶解技术已被广泛应用于牡蛎的水解，以获得具有良好感官品质、功能特性、生理活性和营养价值的酶解产物[3]。但获得合适酶解产物受到多种因素的影响，包括酶种类、底物和水解条件（如酶的浓度、温度、pH和时间）[4]。通过控制水解条件可以提高酶解产物的品质和功能特性，如乳化性和起泡性[5]。适度酶解可以强化酶解产物的功能特性，但酶解过度会造成一些功能特性丧失[6]。因此，控制蛋白质的水解程度对于获得具有较佳功能特性的酶解产物至关重要。

水解度是表征蛋白质水解程度的重要指标。近年来，越来越多研究者关注水解度对水产品酶解产物功能特性和抗氧化活性的影响。袁晓晴等[6]制备水解度为DH 4.5%，9.0%和13.5%鳙鱼肉酶解产物，发现DH 4.5%酶解产物乳化性和起泡性最高，而过度水解后，DH 9.0%和13.5%酶解产物乳化性和起泡性下降。马艳芳等[7]发现螺旋藻肽的起泡性、DPPH清除率和还原力，随着水解度增加呈现先增大后减小趋势，而泡沫稳定性、乳化性和乳化稳定性则随着水解度增大而逐渐减小。周航等[8]制备水解度分别为7.5%，9.4%，10.3%，11.6%和14.6%的鲢鱼肉酶解产物，发现脂质过氧化抑制率、ABTS+·清除率和还原力均随水解度增大而升高。卢彬等[9]制备水解度分别为10.8%，14.9%，19.0%和21.7%鲹鱼肉酶解产物，发现随着水解度增大，酶解产物乳化性、乳化稳定性、起泡性和泡沫稳定性逐渐降低。研究表明，水解度对酶解产物的功能特性和抗氧化活性有重要影响，且不同原料呈现不同规律。前期研究发现，水解度对牡蛎酶解液的感官评分、肽分子量分布和游离氨基酸组成有较大影响[10]。酶解产物组成的差异会引起其功能特性和生理活性变化。现鲜有水解度对牡蛎酶解产物功能特性和抗氧化活性影响的报道。

因此，试验以牡蛎肉为原料，采用胰蛋白酶和风味蛋白酶组成复合酶对其进行限制性水解，获得不同水解度的酶解产物，考察水解度对牡蛎酶解产物功能特性（乳化性、起泡性和泡沫稳定性）和抗氧化活性（DPPH清除率和总还原力）的影响，旨在为牡蛎酶解产物的工业化应用提供研究基础和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

近江牡蛎肉（购自广州龙洞农贸市场，现场去壳取肉后，冰鲜保存，立即运回实验室-18 ℃冻藏）；风味蛋白酶（酶活500 LAPU/g，诺维信中国公司）；胰蛋白酶（酶活4 000 U/g，重庆市全新祥盛生物制药有限公司）；2, 2-二苯基-1-苦味基肼（DPPH，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；浓硫酸、氢氧化钠、盐酸等（均为分析纯）。

DKZ-3B电热恒温振荡水槽（上海一恒科学仪器有限公司）；3K15台式高速冷冻离心机（德国Sigma公司）；K9840凯氏定氮仪（济南海能仪器股份有限公司）；TU-1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；T25高压均质机（艾卡（广州）仪器设备有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 酶解产物制备

称取等重量解冻的牡蛎肉和蒸馏水，混合后迅速打浆，调整浆液pH 7.0，加入牡蛎肉总重量0.6%复合蛋白酶（胰蛋白酶与风味蛋白酶的质量比2︰1），搅拌均匀后在55 ℃水浴摇床中分别酶解不同时间。酶解结束后，煮沸灭酶20 min。室温冷却后在4 ℃条件下以8 000 r/min离心20 min，取上清液-18 ℃冻存备用[1]。酶解时间分别为0，30，60，240和480 min的酶解产物，分别标记为OH0、OH1、OH2、OH3和OH4。

1.2.2 水解度测定

总氮含量测定采用凯氏定氮法。氨基酸态氮含量测定采用甲醛滴定法[11]。水解度（DH）按照式（1）计算。

1.2.3 乳化性能

酶解产物用蒸馏水稀释3倍后，取30 mL稀释后的酶解产物至烧杯中，分别调节pH 4，6，8和10，加入30 mL大豆油，以10 000 r/min均质2 min，迅速将乳化液倒入100 mL离心管中，以3 000 r/min离心5 min，离心后测量乳化层体积[2-3]。

1.2.4 起泡性和泡沫稳定性

酶解产物用蒸馏水稀释3倍后，取30 mL稀释后的酶解产物至烧杯中，分别调节pH 4，6，8和10，以10 000 r/min高速均质2 min后迅速转移至量筒中，量取起始泡沫体积，记录之后5，10，20，30和60 min时的泡沫体积[8]。起泡性及泡沫稳定性按照式（3）和（4）计算。

1.2.5 DPPH的测定

酶解产物用蒸馏水稀释4倍后，取2 mL稀释后的酶解产物于10 mL离心管中，加入2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液，混匀，室温避光放置30 min。以无水乙醇调零，于517 nm波长处测定吸光度[4]。计算如式（5）。

式中：A0为2.0 mL样品溶液+2.0 mL无水乙醇的吸光度；A1为2.0 mL DPPH溶液+2.0 mL无水乙醇的吸光度；A2为2.0 mL样品溶液+2.0 mL DPPH溶液的吸光度。

1.2.6 总还原力的测定

酶解产物用蒸馏水稀释1倍后，取1 mL稀释后的酶解产物于10 mL离心管中，依次加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸缓冲液（pH 6.6）和2.5 mL 1%铁氰化钾，混匀，50 ℃水浴20 min，冷却至室温，加2.5 mL 10%三氯乙酸，混匀。取2.5 mL上清液，加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%三氯化铁，混匀。以蒸馏水调零，于700 nm波长处测定吸光度[5]。

1.3 数据处理

所有测定均进行3次重复试验，取平均值。

2 结果与分析

2.1 牡蛎酶解产物的水解度

蛋白质水解后成为多肽和游离氨基酸，多肽是酶解产物功能特性和抗氧化活性的主要贡献者。不同水解度的酶解产物中多肽分子量分布范围和含量不同。通常水解度越高，多肽分子量分布范围越小，小分子肽含量越高，但呈现较强功能特性和抗氧化活性的多肽分子量具体是多少，未有一个明确的参考依据。因此，探究水解度对酶解产物功能特性和抗氧化活性的影响，是酶解产物中功能性肽和抗氧化肽分离和鉴定的基础，也是酶解产物应用的基础。如图1所示，采用胰蛋白酶和风味蛋白酶组成复合酶对牡蛎进行限制性水解，酶解时间分别为0，30，60，240和480 min时，获得OH0、OH1、OH2、OH3和OH4这5种酶解产物，水解度分别为8.02%，24.75%，28.04%，36.98%和41.20%。牡蛎在贮藏和预处理过程中，其中的内源蛋白酶也会对蛋白质进行酶解，发生蛋白质自溶的过程[6]。因此，酶解时间0 min的牡蛎酶解产物，其水解度也需要被测定和考察。

图1 牡蛎酶解产物的水解度

2.2 乳化性

乳化性是指能将油水结合在一起形成乳状液的能力，是食品加工中重要的性质和质量控制指标。如图2所示，在pH 4环境中，OH0、OH1、OH2、OH3和OH4乳化性分别为44.46%，42.29%，44.61%，42.81%和43.76%。在pH 6环境中，OH0、OH1、OH2、OH3和OH4乳化性分别为44.44%，45.13%，45.81%，43.75%和43.03%。在pH 8环境中，OH0、OH1、OH2、OH3和OH4乳化性分别为45.82%，44.56%，43.08%，43.44%和44.27%。在pH 10环境中，OH0、OH1、OH2、OH3和OH4乳化性分别为41.98%，41.82%，39.97%，39.81%和40.38%。数据分析表明，不同水解度牡蛎酶解产物在不同pH环境中的乳化性差别较小，表明水解度对牡蛎酶解产物乳化性的影响较小。

图2 不同水解度牡蛎酶解产物的乳化性

2.3 起泡性和泡沫稳定性

起泡性是蛋白质应用于食品加工的一项重要功能性质。如图3所示，在pH 4环境中，OH0、OH1、OH2、OH3和OH4起泡性分别为53.84%，56.39%，26.92%，21.40%和16.53%。在pH 6环境中，OH0、OH1、OH2、OH3和OH4起泡性分别为68.15%，70.07%，58.55%，40.99%和29.59%。在pH 8环境中，OH0、OH1、OH2、OH3和OH4起泡性分别为52.57%，51.82%，37.56%，24.96%和13.79%。在pH 10环境中，OH0、OH1、OH2、OH3和OH4起泡性分别为46.13%，55.41%，31.53%，36.11%和18.69%。数据分析表明，OH1在4种pH环境中均有较强的起泡性，在pH 6环境中起泡性最大为70.07%。在pH 4和6环境中，牡蛎酶解产物的起泡性随着水解度的增加呈现先升高后降低的趋势。在pH 8环境中，牡蛎酶解产物的起泡性随着水解度的增加呈现逐渐降低的趋势。在pH 10环境中，牡蛎酶解产物的起泡性则无明显规律。表明水解度对牡蛎酶解产物起泡性的影响较大。

由图4可知，在pH 4环境中，OH3和OH4的泡沫稳定性较强，泡沫稳定性5 min时分别为93.27%和92.06%。OH1在5，10，20，30和60 min时的泡沫稳定性分别为76.74%，75.58%，70.93%，62.79%和23.26%，表明OH1在pH 4环境中，30 min内具有超过50%的泡沫稳定性。由图5可知，在pH 6环境中，OH4的泡沫稳定性较强，泡沫稳定性在5 min时为96.67%。OH1在5，10，20，30和60 min时的泡沫稳定性分别为68.08%，64.32%，58.69%，56.34%和28.17%。表明OH1在pH 6环境中，30 min内仍具有超过50%的泡沫稳定性。由图6可知，在pH 8环境中，OH3和OH4的泡沫稳定性较强，泡沫稳定性在5 min时为分别为91.60%和95.34%。OH1在5，10，20，30和60 min时的泡沫稳定性分别为77.07%，73.89%，68.79%，64.33%和50.89%。表明OH1在pH 8环境中，60 min内具有超过50%的泡沫稳定性。由图7可知，在pH 10环境中，OH1、OH2、OH3和OH4均具有较强的泡沫稳定性，泡沫稳定性在5 min时为分别为85.63%，85.36%，84.30%和84.30%。OH1在5，10，20，30和60 min时的泡沫稳定性分别为77.07%，73.89%，68.79%，64.33%和50.89%。表明OH1在pH 10环境中，60 min内仍具有超过50%的泡沫稳定性。

图3 不同水解度牡蛎酶解产物的起泡性

图4 pH 4时不同水解度牡蛎酶解产物的泡沫稳定性

图5 pH 6时不同水解度牡蛎酶解产物的泡沫稳定性

图6 pH 8时不同水解度牡蛎酶解产物的泡沫稳定性

图7 pH 10时不同水解度牡蛎酶解产物的泡沫稳定性

数据分析表明，OH4在4种pH环境中均有较强的泡沫稳定性。OH1在pH 4和6环境中，30 min内仍具有超过50%的泡沫稳定性。在pH 8和10环境中，60 min内仍具有超过50%的泡沫稳定性。表明水解度对牡蛎酶解产物泡沫稳定性的影响也较大。

2.4 DPPH清除率

DPPH清除率是表征抗氧化剂体外抗氧化活性的重要指标。DPPH是一种稳定的有机自由基，溶于乙醇时溶液呈深紫色，有自由基清除剂存在时，可与其单电子配对使其溶液褪色，吸光度下降，其褪色程度与自由基清除能力呈正相关。如图8所示，OH0、OH1、OH2、OH3和OH4的DPPH清除率分别为35.33%，67.00%，66.00%，76.00%和72.67%。牡蛎酶解产物的DPPH清除率，随着水解度增加，呈现先升高后降低趋势。牡蛎经酶解后，其DPPH清除率提高将近1倍，原因可能是酶的作用使原本隐藏在牡蛎蛋白质内部并且能够增强肽抗氧能力的氨基酸残基暴露出来，生成单电子配对能力强的产物，易于与DPPH结合。OH3的DPPH清除率最高为76.00%。随着水解度增加，OH4的DPPH清除率有所下降，可能因为抗氧化活性肽过度水解，单电子配对能力强的产物生成量下降，从而导致DPPH清除率降低。这与马艳芳等[7]报道螺旋藻肽的DPPH清除率规律一致，随着水解度增加，螺旋藻肽的DPPH清除率呈现先升高后降低趋势。

2.5 总还原力

在总还原力测定中，700 nm处的吸光度与样品的还原能力成正比。吸光度越大，样品的还原能力越强。如图9所示，OH0、OH1、OH2、OH3和OH4的总还原力分别为0.296，0.304，0.318，0.367和0.395。牡蛎酶解产物的总还原力，随着水解度增加呈现逐渐升高趋势。这与周航等[8]报道鲢鱼酶解产物总还原力的规律一致，鲢鱼酶解产物总还原力随水解度增加，吸光度逐渐增大，总还原力逐渐增强。

图8 不同水解度牡蛎酶解产物的DPPH清除率

图9 不同水解度牡蛎酶解产物的总还原力

3 结论

试验采用胰蛋白酶和风味蛋白酶组成复合酶对牡蛎进行限制性水解，获得OH0、OH1、OH2、OH3和OH4这5种酶解产物，水解度分别为8.02%，24.75%，28.04%，36.98%和41.20%，考察水解度对牡蛎酶解产物功能特性（乳化性、起泡性和泡沫稳定性）和抗氧化活性（DPPH清除率和总还原力）的影响。结果表明，水解度对牡蛎酶解产物乳化性影响较小，对起泡性、泡沫稳定性、DPPH清除率和总还原力影响较大。OH1在pH 4，6，8和10环境中均有较强的起泡性，在pH 6环境中起泡性最大为70.07%。在pH 4和6环境中，随着水解度增加，牡蛎酶解产物起泡性呈现先升高后降低趋势。在pH 8环境中，牡蛎酶解产物的起泡性随着水解度的增加呈现逐渐降低趋势。OH4在pH 4，6，8和10环境中均有较强的泡沫稳定性。牡蛎酶解产物的DPPH清除率，随着水解度增加，呈现先升高后降低趋势。OH3的DPPH清除率最高为76.00%。牡蛎酶解产物的总还原力，随着水解度增加呈现逐渐升高趋势。OH4的总还原力最高，为0.395。