超声波协同纤维素酶法提取生姜中姜酚的工艺条件优化

周泊宁，孙晶*

锦州医科大学食品科学与工程学院（锦州 121001）

生姜，属姜科植物。在我国，除东北外大部分地区均有栽培。作蔬菜和调味品供食。《本草纲目》记载：“姜，辛而不荤，去邪辟恶，生啖熟食，醋、酱、糟、盐、蜜煎调和，无不宜之，可蔬可茹，可果可药，其利博矣。”为温肺暖脾养生食品[1]。现代研究表明生姜还具有良好的抗氧化活性以及药用价值，受到了国内外学者的广泛关注[2]。生姜中的化学成分极其复杂，主要分为两个部分，一部分是具有辛辣风味的非挥发性物质，另一部分是具有浓厚香气的挥发性物质[3]。普遍认为非挥发性提取物为生姜中的主要活性部分，姜酚是生姜中的辣味物质，也是生姜中的有效部分之一。现有研究证实姜酚具有抗溃疡、抗氧化、可以刺激血液循环以及防衰老抑制肿瘤等多种功效[4]。姜酚的种类有很多，其中6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚含量较多[5]。因为姜酚类化合物化学性质不稳定，极易受到酸、碱等因素影响，所以姜酚的提取分离及含量的测定都具有较大难度，对于生姜中姜酚提取工艺的研究具有现实意义[6]。常见的生姜提取物辅助提取技术包括微波法、超声辅助提取法及生物辅助提取法等[7]。在超声波辅助法中可运用超声波作用产生空化效应和强烈的振动加快目标提取物的溶出。纤维素酶作为健康安全的复合酶，在食品加工过程中被广泛使用[8]。纤维素酶依据植物细胞壁的组成成分，利用酶的高度专一性等特点，在普通溶剂提取的基础上，加入相应的酶对样品进行预处理，将生姜细胞壁的组成成分降解或者水解，把细胞壁的结构破坏，增加其通透性，使目标物质暴露出来。胶溶或溶解于溶剂中，达到增强细胞内溶物质溶出的目的，是提取胞内有效成分的一种新型提取方法[9]。对于纤维素酶法协同超声波提取生姜中活性物质研究较少，试验通过响应面法对纤维素酶协同超声波法提取姜酚的工艺进行优化，探讨对姜酚提取率的影响，以期获得高效的姜酚提取方法。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

莱芜大姜（锦州市大润发超市）。

纤维素酶（30 U/mg）、香草醛标准品、没食子酸标准品（纯度99%）（上海惠世生化试剂有限公司）；浓硫酸、无水乙醇、苯酚、碳酸钠、葡萄糖、福林酚试剂（均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 主要仪器与设备

UV-2550紫外分光光度仪（日本Shimadzu公司）；HH-S2型电热恒温水浴锅（金坛市良友仪器有限公司）；电子分析天平（北京奥多利斯天平有限公司）；GL20M高速冷冻离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）；KQ5200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；201D型旋转蒸发仪（巩义予华仪器有限公司）；真空冷冻干燥机（美国Labconco公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 生姜提取液的制备

精密称取0.2 g低温烘干，过孔径0.150 mm筛的生姜粉末，加入适量纤维素酶溶液溶解于蒸馏水中。酶解后的液体在50 ℃下用无水乙醇进行萃取，将杂质沉淀后对样品用超声法处理30 min得到生姜提取液，将提取液以5 000 r/min离心10 min，抽滤，取上清液待用[10]。

1.3.2 香草醛标准曲线的绘制

因为香草醛标准品与姜酚结构相似，所以选用香草醛作为对照标准，绘制标准曲线[11]。配制20 μg/mL香草醛标准溶液，用无水乙醇稀释定容，得到质量浓度分别为2，4，6，8，10和12 μg/mL的系列标准溶液，用无水乙醇作为空白对照。用比色皿在波长280 nm处测定的吸光度，求得回归方程为y=0.067 3x-0.004 7，R2=0.999 3。

图1 香草醛标准曲线

1.3.3 姜酚的测定

用无水乙醇稀释上清液于10 mL容量瓶中定容，利用紫外分光光度法测定姜酚得率。在波长280 nm处测定吸光度，根据标准曲线得出姜酚质量浓度，按式（1）计算出姜酚得率[12]。

姜酚得率=2.001V0V1C/（V2W×106）×100% （1）式中：2.001为香草醛换算成姜酚的系数；V0为样品提取液总体积，mL；V1为测定样液总体积，mL；C为溶液质量浓度，μg/mL；V2为测定时吸取的样品供试液体积，mL；W为称取的样品质量，g。

1.3.4 单因素试验设计

1.3.4.1 纤维素酶添加量对姜酚得率的影响

准确称取5份粉碎干燥的生姜粉末，料液比1︰70（g/mL），酶解温度45 ℃时，分别在纤维素酶添加量为0.40%，0.85%，1.30%，1.75%和2.20%条件下提取60 min，用功率为135 W、温度60 ℃的超声波清洗机中提取30 min，考察纤维素酶添加量对姜酚得率的影响。

1.3.4.2 酶解温度对姜酚得率的影响

准确称取5份粉碎干燥的生姜粉末，料液比1︰70（g/mL），纤维素酶添加量1.30%时，温度分别为35，40，45，50和55 ℃酶解60 min，采用功率135 W、温度60 ℃的超声波清洗机中提取30 min，考察酶解温度对姜酚得率的影响。

1.3.4.3 酶解时间对姜酚得率的影响

准确称取5份粉碎干燥的生姜粉末，料液比1︰70（g/mL），纤维素酶添加量1.30%，酶解温度45 ℃下分别酶解40，50，60，70和80 min，采用功率135 W、温度60 ℃的超声波清洗机中提取30 min，考察酶解时间对姜酚得率的影响。

1.3.4.4 超声功率对姜酚得率的影响

准确称取5份粉碎干燥的生姜粉末，料液比1︰70（g/mL），纤维素酶添加量1.30%，温度45 ℃下酶解60 min，功率分别为105，120，135，150和165 W，在温度60 ℃的超声波清洗机中提取30 min，考察超声功率对姜酚得率的影响。

1.3.5 响应面法试验因素水平设计

在单因素试验基础上，选取纤维素酶添加量（A）、酶解温度（B）、酶解时间（C）、超声功率（D）4个因素作为自变量，编码水平为-1，0和1，以姜酚得率为响应值设计四因素三水平响应面试验，利用Design-Expert 8.0.6软件的Box-Behnken中心组合试验设计原理进行响应面试验[13-15]。结果见表1。

表1 响应面分析的因素水平

1.4 数据处理

所有数据均进行3次测定，p＜0.05被认为具有统计学差异，结果表示为平均值±标准差（X±SD）。数据统计分析采用Design-Expert 8.0.6，差异显著性（p＜0.05）；趋势线使用Microsoft Excel软件计算绘制。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 纤维素酶添加量对姜酚得率的影响

图2为不同纤维素酶添加量对姜酚得率的影响。随着加酶量增大，姜酚得率逐渐增大。因为纤维素酶与生姜细胞壁上的纤维素的结合后结构被破坏，更多的纤维素被水解或降解，增大细胞的通透性，提高姜酚得率。加酶量大于1.30%后，由于生姜细胞壁上的结合位点全部被酶分子占据达到饱和状态，不会再加强酶解效果[16]。故选择纤维素酶添加量1.30%为宜。

图2 纤维素酶添加量对姜酚得率的影响

2.1.2 酶解温度对姜酚得率的影响

图3为不同酶解温度对姜酚得率的影响。随着温度升高，姜酚得率逐渐增大。这是由于温度升高，分子运动加快，有利于酚类物质析出；但温度高于45 ℃时得率增加幅度明显减小，是因为有乙醇挥发，可能会破坏提取出的姜酚[17]。故选择酶解温度45 ℃为宜。

图3 酶解温度对姜酚得率的影响

2.1.3 酶解时间对姜酚得率的影响

图4为不同酶解时间对姜酚得率的影响。随着酶解时间增加，姜酚得率逐渐增大。是因为酶解时间短，姜酚提取不充分；但酶解时间60 min后，延长酶解时间，可能由于长时间的浸泡分子结构遭到破坏且有其他杂质溶出导致姜酚的得率降低[18]。故选择酶解时间60 min为宜。

2.1.4 超声功率对姜酚得率的影响

图5为不同超声功率对姜酚得率的影响。随着超声功率增加，姜酚得率增大，这是由于适当强度的超声功率可以加快酶反应。但功率过大时，超声波的机械作用可使分子的运动速度增加、植物的细胞结构被破坏，会使生姜中其他组分被提取出来或将提取出的姜酚成分破坏，影响提取效果，导致姜酚得率下降[19]，所以超声功率大于135 W时得率增加幅度明显减小。故选择超声功率135 W为宜。

图4 酶解时间对姜酚得率的影响

图5 超声功率对姜酚得率的影响

2.2 响应面试验结果分析

2.2.1 回归模型方差分析

在单因素试验结果基础上，选择纤维素酶添加量、酶解温度、酶解时间、超声功率4个因素为自变量，姜酚得率为响应值，采用Design-Expert 8.0.6软件进行四因素三水平的响应面试验设计，结果如表2。

利用Design-Expert 8.0.6软件对试验数据进行多元拟合回归分析得到姜酚得率（Y）的回归方程：Y=1.90+0.076A-0.056B+0.030C-0.015D+0.01AB+0.018AC-0.035AD-0.020BC+2.500E-003BD+7.500E-003CD-0.13A2-0.069B2-0.090C2-0.083D2。

由表3可知，回归方程的模型p＜0.01，说明该回归方程极显著。F值可以直观地反应各个因素对姜酚得率的影响大小，并且F值越大，则对响应值的影响也越大。由表3得知，4个因素对姜酚得率影响大小的顺序为纤维素酶添加量＞酶解温度＞酶解时间＞超声功率。从表3还可以看出一次项A、B和二次项A2、B2、C2、D2和一次项C对姜酚得率影响极显著，交互项AD对姜酚得率影响显著，其他因素不显著。

表2 响应曲面试验结果

表3 二次回归模型的方差分析

2.2.2 响应面分析及优化

为进一步探讨纤维素酶添加量、酶解温度、酶解时间、超声功率对响应值的影响，可视化分析各个因素之间的交互作用，回归方程响应面如图6～8。随着纤维素酶添加量、酶解温度、酶解时间、超声功率增大，姜酚得率呈现先升高再降低趋势，与单因素试验结果一致，响应面图都较陡峭且有最大值[20-21]。响应面和等高线三维图可用于解释自变量之间的交互作用。从响应面的陡峭程度可判断两因素对响应值的作用是否显著，一般响应面越陡峭，说明两因素交互作用越显著[22-24]。

图6 纤维素酶添加量及酶解温度对姜酚得率交互作用的响应面和等高线图

图7 纤维素酶添加量及超声功率对姜酚得率交互作用的响应面和等高线图

图8 酶解时间及酶解温度对姜酚得率交互作用的响应面和等高线图

从图6可知，当纤维素酶添加量一定时，姜酚得率随着酶解温度的增加呈现先升高后减降低的趋势；酶解温度一定时，姜酚得率随着纤维素酶添加量的增加呈现先升高后降低的趋势。等高线接近圆形，表明纤维素酶添加量与酶解温度的交互作用不显著，这与回归方程方差分析的结果相符。

由图7可知，纤维素酶添加量一定时，姜酚得率随着超声功率增加呈现先增大后减小趋势；超声功率一定时，姜酚得率随着纤维素酶添加量增加呈现先增大后减小趋势。通过对等高线形状和响应面的陡峭程度分析，等高线密集，且接近椭圆形，响应面坡度较陡峭，可知纤维素酶添加量与超声功率交互作用对响应值的影响显著。

由图8可知，酶解温度一定时，姜酚得率随着酶解时间增加呈现先增大后减小趋势；酶解时间一定时，姜酚得率随着酶解温度增加呈现先增大后减小趋势。响应面坡度较小且等高线接近圆形，说明酶解温度与酶解时间交互作用不显著。因素交互的分析结果验证回归模型方差分析结果。

2.2.3 验证试验

通过软件Design-Expert 8.0.6分析得到最佳姜酚提取条件为纤维素酶添加量1.44%、酶解温度42.91 ℃、酶解时间62.38 min、超声功率132.67 W，在此条件下姜酚得率的理论值可达1.924 6%。出于对试验条件的可操作性考虑，进一步将提取工艺条件修正为纤维素酶添加量1.30%、酶解温度45 ℃、酶解时间60 min、超声功率135 W。经3次验证性试验，姜酚得率为1.89%，与理论预测值相近，说明该响应面结果可靠。

3 结论

对超声波辅助纤维素酶法提取生姜中姜酚的工艺进行优化。通过单因素试验考察纤维素酶添加量、酶解温度、酶解时间和超声功率4个因素对姜酚得率的影响，在单因素试验结果的基础上进行Box-Behnken中心组合设计和响应面分析，结果表明纤维素酶添加量和酶解温度对姜酚得率的影响极显著，酶解时间影响显著，而超声功率不显著。两因素间的交互作用对姜酚得率影响较明显的是纤维素酶添加量和超声功率。优化后的姜酚得率提取工艺为纤维素酶添加量1.30%、酶解温度45 ℃、酶解时间60 min、超声功率135 W。在该条件下实际测得姜酚得率为1.89%，与理论预测值相近，说明试验所建立的回归模型较为准确，优化方案合理可行。