电针联合骨髓间充质干细胞促进心肌缺血再灌注损伤大鼠血管新生作用机制研究*

王秀珍，邹 伟，马育轩，赵 楠，高长玉，王特哈斯，彭宇飞△

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001;3.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

经皮冠状动脉介入治疗、溶栓治疗能够减少心肌梗死面积和挽救濒死心肌，但是在恢复血供后损伤反而愈加严重，这一现象称为心肌缺血再灌注损伤(Myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)[1]。介入和药物治疗虽然取得了一定进展，但患者疾病后期还可能出现血管再狭窄、闭塞等现象。因此，血管新生“自身搭桥”成为目前现代医学研究的热点。骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells，BMSCs)经诱导可分化为心肌细胞，促进心肌修复。受梗死区域微环境的影响,BMSCs分化为心肌细胞十分困难，因此寻找一种可靠的诱导方法是本课题研究的关键。化学药物诱导可能存在细胞毒性；中药复方成分复杂，在应用前需要做细胞毒性鉴定；而针灸具有无毒、无副作用的特点。因此本课题通过制备MIRI模型，选用电针作为诱导方法观察BMSCs移植后促进梗死区域血管新生状况，为电针调控BMSCs向心肌细胞分化、迁移和归巢提供研究基础。

1 材料

1.1 实验动物

选用4～6周SPF级SD大鼠10只，体质量(100±10)g,用于提取BMSCs；SPF级SD雄性大鼠90只，体质量(200±10)g,用于移植，上述实验动物由黑龙江中医药大学动物实验中心提供[合格证号为：SCXK(黑)2016004]，通风，普通饲养，实验过程按照《关于善待实验动物的指导性意见》文件要求执行。

1.2 实验仪器

流式细胞仪(美国Milipore);倒置相差显微镜(美国SCILOGEX);TC2323二氧化碳培养箱(美国SL);超纯水仪(美国密理博公司);低温高速离心机MIKRO 220(德国Hettich公司);HX-200动物呼吸机(成都泰盟科技有限公司);2135型切片机(德国菜卡公司);Glamour 2000型全自动生化仪(美国M.D.仪器公司)。

1.3 实验试剂

青霉素链霉素溶液(Hyclone公司);特级胎牛血清(Hyclone公司);胰酶细胞消化液(Beyotime公司);MTT(美国Sigma);CD90、CD45(美国eBioscience);DMSO(中国凯基);CK-MB、cTnI试剂盒(南京建成生物工程有限公司);TTC(美国Sigma公司)、抗荧光淬灭剂(中国Solarbio);酶标仪(美国BIOTEK);Image-pro plus6.0分析系统(麦克奥迪实业集团有限公司)。

1.4 BMSCs的分离、培养与鉴定

1%戊巴比妥那腹腔麻醉大鼠，颈椎脱臼法处死，消毒，剪断胫骨和股骨两侧骺端，充分暴露髓腔，采用全骨髓贴壁法进行培养。方法：加入浓度为15%胎牛血清的完全培养液重悬细胞，在温度37 ℃、浓度为5% CO2培养箱内培养，标记为第一代(P0)，P0代细胞稳定培养48 h后，首次半量换液，剔除悬浮液，以后每2～3 d全量换液1次，每日于镜下观察BMSCs融合及生长形态情况,待P1代细胞融合达80%～90%左右，0.25%胰酶-0.02%EDTA消化后进行传代，按1∶2比例传代，标记为P2代，以此类推，P3代细胞长满后，用流式细胞仪鉴定细胞表面抗原。

2 方法

2.1 造模方法

术前禁食、不禁水12 h，1%戊巴比妥那腹腔麻醉，行气管插管术，呼吸机辅助通气(通气频率约50次/min)，心脏暴露充分，结扎冠状动脉左前降支，拉紧并固定缝合线。观察心电图变化，Ⅱ导联出现ST段抬高、T波高耸和倒置，提示心肌缺血形成。30 min后松开止血钳，恢复再灌注60 min，再灌注损伤成功标志以Ⅱ导联上抬的ST段下降50%或高耸的T波下降为准。

2.2 分组及移植

将大鼠随机分为5组，每组6只。分别为假手术组、模型组、电针组、BMSCs组和电针+BMSCs组。假手术组：只穿线不结扎；模型组：行心肌MIRI造模，造模成功后在缺血区以心尖方向为6点方向，分别在3点、6点和9点3个位点注射生理盐水；电针组：MIRI造模成功后，给予电针治疗，参照相关文献等[2-3]制定的《实验动物穴位图谱》取穴，内关穴定位(PC6)：前肢内侧离腕关节约3 mm的尺桡骨缝间，用0.30 mm×25 mm毫针针刺，针刺深度约5 mm，双侧“内关”穴接正极，“内关”穴近心端上约1.5 mm处刺入一根毫针接负极，连接电针疏密波(疏波2 Hz，密波100 Hz)刺激，强度以局部呈现稍微振动为宜，治疗30 min，1次/d；BMSCs组：造模成功后，立即在心肌梗死区及周边区3个点各注射BMSCs细胞25 μL(细胞预先用CM-Dil标记，细胞数目5×106)；电针+BMSCs组：造模成功后，移植方法同BMSCs组，电针治疗同电针组。各组连续治疗14 d，分3 d、7 d和14 d 3个时间点取材。

2.3 指标检测

2.3.1 BMSCs生长形态 待P1代细胞融合达80%～90%左右，0.25%胰酶-0.02%EDTA消化后进行传代，按1∶2比例传代，标记为P2代，以此类推，P3代细胞长满后，倒置显微镜观察细胞生长状态。

2.3.2 细胞生长趋势 培养BMSC细胞至密度为90%左右，加入0.2%胰酶消化，置于37 ℃、5%CO2的条件下连续培养7 d，分别进行MTT检测。

2.3.3 BMSCs的鉴定 流式细胞仪检测以CD45阳性率低于5%、CD90阳性率高于90%鉴定所得细胞为高纯度的BMSCs。

2.3.4 CK-MB、cTnI含量的测定 各时相点治疗结束后腹主动脉取血，离心机转速3 000 r/min，离心10 min，收集血清，采用Glamour 2000型全自动生化仪检测CK-MB、cTnI的含量。

2.3.5 大鼠心肌梗死面积 取厚度为1～2 mm心肌片，置于1%TTC染液中，4%多聚甲醛固定，拍照记录，正常心肌染色呈红色，坏死心肌呈灰白色。

2.3.6 心肌组织病理形态 各时相点结束后迅速取出心脏，切取约2 mm3心肌组织，4%多聚甲醛固定。包埋、逐级脱水、二甲苯透明、HE染色和镜检400倍下显微镜下观察。

2.3.7 细胞移植存活状态 切取约2 mm3心肌组织，包埋样本，切取10 μm的薄片，蒸馏水浸洗，加抗荧光淬灭剂，镜下400倍拍照。

2.3.8 CD31、SDF-1蛋白含量 取约2 mm×2 mm×2 mm心肌组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋、乙醇逐级脱水和二甲苯透明后，加入一抗、二抗，DAB显色、苏木素复染并在400倍镜下观察。

2.4 统计学处理

3 结果

3.1 大鼠BMSCs体外生长的形态学特征

倒置显微镜下观察24 h后绝大部分BMSCs已经开始贴壁伸展生长，形态呈类圆形、梭型、多角形及星型等不规则形态且数目较多；约4～6 d后，生长速度显著增加，形成细胞集落，每个集落由中心向四周融合成片，细胞形状呈多角形、短梭形，形态呈“旋涡样”生长。见图1。

图1 BMSCs倒置显微镜下观察细胞形态

3.2 BMSCs生长曲线

BMSCs传代后生长曲线在1～4 d左右迅速增殖，生长旺盛，5～7 d左右达到平台期，此时细胞增殖达到高峰。见图2。

图2 BMSCs生长曲线

3.3 BMSCs表面抗原的鉴定

流式细胞仪检测结果显示CD45阳性率低于5%、CD90阳性率高于90%，提示细胞纯度较高，均一性较好，符合后续实验要求。见图3。

图3 BMSCs CD45、CD90的表达

3.4 各组大鼠心肌酶CK-MB、cTnI含量的变化

实验结果显示，与假手术组比较，其他各组各个时相点CK-MB、cTnI含量明显升高，说明造模成功；与模型组比较，各治疗组各个时相点CK-MB、cTnI含量明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)，其中电针+BMSCs组较电针组和BMSCs组CK-MB、cTnI水平下降更加明显，差异有统计学意义(P<0.05)；随着时间延长，各治疗组CK-MB、cTnI呈现逐渐下降的趋势；与再灌注3 d比较，7 d、14 d时CK-MB、cTnI水平显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)；与再灌注7 d比较，14 dCK-MB、cTnI水平明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)，其中以电针+BMSCs组疗效更为显著，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1～2。

表1 各组大鼠各时相点CK-MB含量的变化

表2 各组大鼠各时相点cTnI含量的变化

3.5 各组大鼠心肌梗死面积的变化

实验结果显示，TTC染色后肉眼可见心肌梗死区呈现灰白色。与模型组比较，各治疗组各时相点梗死面积明显缩小,差异有统计学意义(P<0.05)，电针+BMSCs组梗死面积与电针组和BMSCs组比较显著较少,差异有统计学意义(P<0.05)；随着时间延长，各治疗组梗死面积呈现逐渐缩小的趋势；与再灌注3 d比较，再灌注7 d各治疗组差异无统计学意义(P>0.05)，14 d各治疗组差异有统计学意义(P<0.05)；与再灌注7 d比较,14 d梗死面积显著减少,差异有统计学意义(P<0.05)，其中以电针+BMSCs组疗效更为显著,差异有统计学意义(P<0.05)。见图4、表3。

图4 各组大鼠各时相点心肌梗死面积的变化(%)

表3 各组大鼠各时相点心肌梗死面积的变化

3.6 各组大鼠心肌组织病理形态学变化

HE染色显示：假手术组心肌结构未见明显异常；模型组可见细胞间质水肿、炎性细胞浸润、毛细血管扩张甚至心肌纤维出现断裂和溶解等现象；电针组、BMSCs组和电针+BMSCs组未见有明显的炎性细胞浸润、肿胀,心肌纤维排列较为规则，说明损伤程度明显减轻，电针+BMSCs组减轻尤其显著。见图5。

图5 各组大鼠心肌组织病理形态学变化(14 d,400×)

3.7 荧光显微镜检测BMSCs移植存活状态

采用荧光显微镜下观察，BMSCs组在心肌中呈现出良好的生长增殖状态，随着时间的延长BMSCs数目呈现递增趋势，电针+BMSCs组与之比较，效果更加明显。见图6。

图6 移植组各时间点荧光显微镜检测细胞移植存活状态

3.8 免疫组化检测CD31、SDF-1蛋白含量的变化

3.8.1 CD31标记的微血管密度比较 CD31定位于血管内皮细胞胞浆或包膜上，免疫组化染色后呈“棕黄色或黄褐色”即阳性表达，新生血管呈棕黄色。与假手术组比较，其他各组各时相点梗死边缘区微血管密度(IOD值)均有不同程度的升高,差异无统计学意义(P<0.05)；再灌注3 d时，与模型组比较，BMSCs组、电针+BMSCs组IOD值明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)，电针组升高不明显,差异有统计学意义(P>0.05)；再灌注7 d时，与模型组比较，电针组、电针+BMSCs组IOD值明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)，电针+BMSCs组升高更为明显，BMSCs组升高无统计学意义(P>0.05)；再灌注14 d时各治疗组微血管密度(IOD值)明显升高(P<0.05)，其中电针+BMSCs组微血管密度(IOD值)明显高于电针组及BMSCs组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表4、图7。

表4 各组大鼠各时相点CD31 IOD值的变化

图7 各组心肌组织中CD31蛋白表达水平(14 d，400×)

3.8.2 各组大鼠SDF-1蛋白含量变化 SDF-1定位于细胞胞质，免疫组化染色后呈“棕黄色或黄褐色”即阳性表达，新生毛细血管呈棕黄色。与假手术组比较，其他各组各个时相点SDF-1蛋白含量明显升高；与模型组比较，各治疗组各个时相点SDF-1蛋白含量明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)，其中电针+BMSCs组较电针组和BMSCs组SDF-1蛋白水平升高更加明显,差异有统计学意义(P<0.05)；随着时间延长，各治疗组SDF-1蛋白呈现逐渐升高的趋势；与再灌注3 d比较，7 d、14 d时SDF-1蛋白水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)；与再灌注7 d比较，14 d时SDF-1蛋白水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)，其中以电针+BMSCs组疗效更为显著,差异有统计学意义(P<0.05)。见表5、图8。

表5 各组大鼠各时相点SDF-1 IOD值的变化

图8 各组心肌组织中SDF-1蛋白表达水平(14 d，400×)

4 讨论

心肌缺血再灌注损伤这一病名在中医学中无记载，但是根据其临床表现可以将其归属于“胸痹”“心痛”“厥心痛”“真心痛”等范畴。《黄帝内经》曰：“邪客于足少阴之络，令人卒心痛”，是中医学对心血管内科急症较早的文献记载。《灵枢·经脉》曰：“心胸内关谋 ”，《标幽赋》曰：“胸满腹痛刺内关”。内关穴属手厥阴心包经，通阴维，络穴。“经脉所过，主治所及”，其有宁心安神、宽胸理气之效，内关穴治疗缺血性心肌病具有经穴特异性[4-7]。现代研究表明机体自身具有内源性预适应的作用[8-10]，针灸治疗能够激发人体自身正气，达到“正气存内，邪不可干”的平衡状态。现代研究认为电刺激能够促进BMSCs向心肌细胞的分化[11-12]。因此本课题选用电针内关穴联合BMSCs移植治疗MIRI，以期阐明其对血管新生的作用机制。

利用BMSCs 的贴壁特性采用全骨髓贴壁法进行细胞分离，该法操作简便、容易掌握且提取的BMSCs 纯度高、分化能力强，提取过程中保留了骨髓中其他的伴生细胞，最大程度地模拟了内环境[13]。国际细胞治疗协会制定BMSCs的鉴定标准:①表达CD73、CD90和CD105而不表达CD34、CD45等;②贴壁生长，高度增殖分化；③在体外可以分化为脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞[14]。本实验结果显示BMSCs 增殖较为活跃，细胞生长曲线呈S形，细胞表面抗原显示出BMSCs的特性，CD45阳性率<5%，CD90阳性率>90%，表明细胞纯度较高、均一性良好。在急性心肌梗死(AMI)发生3～6 h后血清中CK-MB含量可迅速升高[15-16]，美国与欧洲心脏病协会同时强调AMI的诊断标准cTnI的升高尤其重要[17],梗死面积是评价心肌受损程度最直观、最明确的指标。本实验主要通过建立MIRI大鼠模型，以血清中 CK-MB、cTnI的活性来评价心肌受损程度，以心肌梗死面积评价药物治疗效果，本实验结果显示，随着时间的延长，各治疗组均能够降低大鼠心肌酶CK-MB、cTnI及心肌梗死面积水平，但是以电针+BMSCs组效果最显著,差异有统计学意义(P<0.05)。HE染色具有观察直观的特点,HE染色后肌纤维、胶原纤维、细胞质及红细胞呈现深浅不一的红色，细胞核着色为蓝色；随着治疗时间的延长，各治疗组细胞损伤逐渐修复，其中以电针+BMSCs组疗效显著，从病理形态学角度证实电针联合BMSCs移植能够减少炎性细胞浸润，改善心肌纤维紊乱的状态。荧光显微镜下观察BMSCs组在心肌中呈现出良好的生长增殖状态，随着时间的延长BMSCs数目呈现递增趋势，电针+BMSCs组与之比较，效果更加明显，说明在电针的诱导下BMSCs在心肌内增殖状态良好。微血管密度(MVD)能够直观反映侧支循环建立情况和新生血管密度及数目，抗血小板内皮细胞黏附分子(CD31)是一种内皮细胞连接分子,能够特异性表达血管生成情况，采用免疫组化方法标记抗体CD31能够间接反映血管新生情况。基质细胞衍生因子(SDF-1)在内皮祖细胞迁移、梗死区域募集及血管新生等方面具有重要作用[18-20]。杨颖博等[21]临床观察急性冠脉综合征患者血清中SDF-1水平明显降低，这一趋势与疾病严重程度呈正相关，充分说明在心脏组织中SDF-1可提高心肌细胞活力，促进血管新生，改善心功能。本实验结果显示：CD31、SDF-1经过免疫组化染色后均呈“棕黄色或黄褐色”，即阳性表达，电针+BMSCs组治疗效果明显优于其他治疗组,差异有统计学意义(P<0.05)，在14 d时CD31呈现高表达,说明经过电针+BMSCs组治疗后梗死区域微血管密度增加，间接反应出毛细血管数量呈现持续增加，侧支循环开始建立，逐步促进血管新生。

综上所述，电针联合BMSCs移植对MIRI大鼠心肌具有保护作用，其机制可能与促进BMSCs在心肌内增殖、有效减少MIRI大鼠的心肌酶水平、减小心肌梗死面积、改善心肌病理改变、增加微血管密度和促进血管新生有关。