治疗缺血性脑卒中的网络针灸学研究*

谌爱华，蒋 冰，王妙华，吴嘉萍，杨雨婷，贺福元,2△，邓凯文,3△

(1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.中药成药性与制剂制备湖南省重点实验室，湖南 长沙 410208；3.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007)

缺血性脑卒中属中医“中风”范畴，是由各种原因造成局部脑组织血液供应障碍，引发的脑组织缺血缺氧性坏死，如不经及时治疗，对患者的生活质量及生活自理能力产生极大影响，且有较高的致残、致死和复发风险。我国每年新发脑卒中人数逐渐增多，速率增长迅速，远高于全球平均水平[1]。脑缺血后神经元损伤一旦超过治疗时间窗，就无法自然修复，造成严重后果，故探讨其发病机制及有效防治措施，是国内外医学研究的重点。针刺治疗缺血性脑卒中疗效显著，但其治病机制尚未完全阐明[2]。随着现代生物分子网络的发展及各学科的交叉渗透，基于“网络生物学”“网络药理学”的发展，“网络针灸学”也应运而生，常规的关于针刺效应机制的研究多为单一因素的研究，对于最终效应产生的各个过程的研究十分匮乏，且对于各个环节之间的相互影响、相互联系的网络关系了解甚少，缺乏系统的研究和规律的提炼，也未与其他学科相交流，对于针灸现代化的研究推动作用较小。网络针灸学[3]是在“疾病-穴位-基因-靶点”相互作用关系基础上，与边缘学科相互融合，运用复杂网络分析手段，研究穴位的配伍及产生效果的生物学机制，其研究重点是在可视化生物分子网络中反映穴位效应、病证的关系，以网络为基础观察穴位对疾病的干预和影响，发现腧穴配伍的功能和作用机制。郭义教授[4]指出，针刺效应的产生是针刺启动穴位局部“穴网络”，从而调节机体神经-内分泌-免疫大网络，最终作用于靶器官“病网络”，至于如何从“小网络”影响到“大网络”，其过程十分繁杂，只有将各个部分建立相互联系、相互影响的复杂网络模型，才能解决针灸作用规律。因此，本研究采用网络针灸学方法，以网络为基础建立穴位、靶点及缺血性脑卒中之间的关系，探究针刺治疗缺血性脑卒中的有效穴位及主要作用机制。

1 资料与方法

1.1 文献检索

检索中国知网(CNKI)数据库、万方数据库和维普中文期刊数据库中的文献。检索时限：2009年7月—2019年7月。检索方式：主题词检索。检索词：“针刺”“针灸”+“脑缺血”“缺血性脑卒中”“缺血性卒中”“脑梗死”“脑梗塞”“脑栓塞”“缺血性中风”“MCAO”“大脑中动脉缺血”“大脑中动脉栓塞”“大脑中动脉阻塞”“大脑中动脉梗阻”“大脑中动脉闭塞”。

1.2 文献纳入标准

①以毫针或电针治疗脑缺血的实验研究文献；②与分子机制相关的动物实验研究；③硕博士论文中关于动物实验分子机制方面的研究；④脑缺血再灌注；⑤文献所选取腧穴有具体定位及归经。

1.3 文献排除标准

①合并其他方法治疗脑缺血的文献；②脑缺血合并其他疾病的文献；③无具体腧穴定位及归经的文献；④临床研究、系统评价、Meta分析和综述类文献；⑤会议论文；⑥除外耳穴、眼针等疗法；⑦重复文献(保留发表文献最近的1篇)。

1.4 建立数据库

对筛选、纳入的文献进行整理，数据录入到Excel电子表格保存，根据穴位、穴位归经、靶点名称、针刺效应和文献来源等进行分类整理。参考《经络腧穴学》，对穴位名称与归经进行规范化处理。将符合要求的数据建立针刺治疗缺血性脑卒中的“经脉-穴位-靶点数据库”。

1.5 分析软件及数据库

Cytoscape 3.6.1软件；DAVID数据库。

2 结果

2.1 频次分析

通过上述检索方式及参照纳入标准与排除标准，符合标准的文献有437篇，共涉及腧穴65个，取穴频次最多的为百会穴，达278次；属于特定穴的腧穴有51个，使用最多的特定穴为五输穴，共21个，其次为交会穴，共19个；督脉选用频次最高，共686次，选用穴位数量最多的经脉为足少阳胆经，共计11个腧穴；文献中共涉及靶点371个，其中TNF-ɑ及GFAP使用频次最多，各24次。

2.2 经脉-穴位-靶点网络

Cytoscape3.6.1软件为一种能将网络可视化，并能进行分析的系统软件，可通过生物分子相互作用网络可视化的形式将高通量基因表达数据、分子状态信息有机整合在一起，将其用节点与边的形式表现出来，便于较直观地观察网络之间的关系。用该软件构建经脉-穴位-靶点网络，通过network analyzer分析穴位与靶点之间的网络特征，计算节点的度值(degree)及中介中心性(betweenness)，观察针刺穴位与缺血性脑卒中靶点的关联情况，评价穴位及靶点的拓扑相关性。缺血性脑卒中经脉-穴位-靶点网络如图1所示。

注:蓝色代表经脉，红色代表穴位，绿色代表靶点。

2.3 网络拓扑学属性

本网络中共涉及450个节点，包括371个靶点，腧穴65个，经脉14条,如表1～2所示。节点的度值代表网络中和节点相连路线的条数，度值越大，其相关性越高。

2.4 关键靶点的选择

将表1中的371个靶点的度值进行降序排列，并计算所有靶点的累计百分比，选取计算结果≥70%的临界靶点及其之前的靶点，共计149个，将该149个靶点与樊启猛等[5]人研究的与缺血性脑卒中紧密相关的46个靶点进行重合，筛选出相同靶点，相同的靶点代表针刺治疗缺血性脑卒中的有效靶点，重合后共计有18个靶点，分别为TNF-α、CASP3、IL-1β、Bcl-2、MMP-9、SOD、IL-6、NF-κB、BDNF、ICAM-1、TGF-β、P38MAPK、AIF、MMP2、VEGFR2、ERK1、HO-1及P-selectin；同时按上述方法计算65个穴位度值的累计百分比，选取累计百分比≥60%的临界穴位及之前的穴位，共计8个，分别为百会、水沟、足三里、内关、曲池、大椎、合谷及神庭。

表1 与针刺治疗缺血性脑卒中相关的靶点(按度值大小排序)

表2 针刺治疗缺血性脑卒中相关的穴位(按度值大小排序)

2.5 GO功能富集及KEGG通路富集分析

DAVID数据库为生物学数据和分析工具，为大量基因或蛋白列表提供系统综合的生物功能注释信息，常用的主要有gene ID的转换、差异基因的功能注释和通路富集分析。用该数据库对上述18个关键靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，GO富集分析共收集到170条相关结果，根据P<0.000 01，有8条符合要求,如表3所示，发现针刺治疗缺血性脑卒中的关键靶点基因功能信息主要富集于胚胎植入、细胞外空间、蛋白质磷酸化、激活MAPK活性、卵巢卵泡发育和对药物的反应等方面；KEGG信号通路显示，针刺治疗脑缺血靶点涉及的KEGG通路共有57条，根据P<0.000 01，发现靠前的通路主要有8条,如表4所示，分别与MAPK信号通路、NOD样受体信号通路、Pertussis、Tuberculosis及Chagas disease(American trypanosomiasis)等相关。

表3 针刺治疗缺血性脑卒中的关键靶点富集信息(P<0.000 01)

表4 针刺治疗缺血性脑卒中关键靶点通路信息(P<0.000 01)

3 讨论

本研究基于文献检索，发现与针刺治疗缺血性脑卒中相关的腧穴有65个，其中百会穴选用次数最多，达278次；属于特定穴的腧穴有51个，使用最多的特定穴为五输穴，共21个，督脉选用次数最多，达686次；足少阳胆经选用腧穴数目最多，共11个；涉及靶点有371个，其中TNF-ɑ及GFAP使用频次最多，各24次。通过构建经脉-穴位-靶点网络，发现针刺治疗缺血性脑卒中的关键穴位共计8个，分别为百会、水沟、足三里、内关、曲池、大椎、合谷与神庭，主要涉及督脉、足阳明胃经、手阳明大肠经和手厥阴心包经；其治疗关键靶点共18个，分别为TNF-α、CASP3、IL-1β、Bcl-2、MMP-9、SOD、IL-6、NF-κB、BDNF、ICAM-1、TGF-β、P38MAPK、AIF、MMP-2、VEGFR2、ERK1、HO-1及P-selectin。

缺血性脑卒中主要原因为脑血管闭塞不通、脑功能异常，从而导致神志障碍及肢体感觉、运动障碍。针刺治疗时多选用头局部穴位及患侧肢体穴位。百会位于督脉，为足厥阴肝经、六阳经和督脉交会穴，可开窍醒神、平肝熄风，能显著降低大鼠的神经功能缺损症状[6]。水沟亦属督脉经穴，为督脉与手足阳明经之交会穴，可通督醒脑、开窍醒神，能有效抑制缺血侧半暗带区细胞凋亡及降低钙离子浓度，减轻缺血缺氧所造成的损伤程度[7]。内关属手厥阴心包经，为络穴、八脉交会穴，通于阴维脉，可养心安神，能通过促进内皮细胞增殖和迁移来加速新血管的形成[8]。大椎位于督脉，为六阳经与督脉交会穴，可调神通督、匡扶阳气，改善脑缺血后的神经功能障碍[9]。阳明经穴在治疗本病时优势明显，手足阳明经均为多气多血之经，治疗本病时也常取此二经穴位，足三里与曲池分属足阳明胃经与手阳明大肠经的合穴，经脉经气可通过合穴深入于脏腑，故针刺阳明经之合穴，可补气养血、平调脏腑功能，且研究显示[10]，针刺曲池和足三里能促进脑缺血后大鼠神经功能缺损的恢复，缩小脑部缺血区面积。合谷属手阳明大肠经，可疏风舒筋、行气活血，刺之可增加局部筋脉气血的濡养，且可激活同侧小脑后叶上半月小叶以及对侧小脑后叶下半月小叶[11]。神庭属督脉，为督脉与膀胱经、胃经之交会穴，可益智醒神开窍，明显提高患者认知功能[12]。

现代医学认为，缺血性脑卒中发生的根本原因在于大脑供血动脉被栓子堵塞，缺血侧脑组织因急性缺血缺氧而引发炎症反应、微血栓形成、脑细胞能量衰竭与缺氧去极化、自由基的毒性作用、Ca2+超载的细胞毒、兴奋性氨基酸毒性损伤与细胞凋亡等一系列过程[13]。通过分析所得18个关键靶点中，TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κB、ICAM-1及P38MAPK主要参与缺血后炎症反应，CASP3、MMP-2、MMP-9、Bcl-2、AIF、ERK1与细胞坏死及凋亡相关，SOD、HO-1主要调控缺血后氧化应激反应，P-selectin主要参与血栓形成，BDNF、TGF-β主要参与神经细胞的再生修复，VEGFR2与血管新生关系密切。脑缺血发生后，包括TNF-α、IL在内的炎症因子大量表达，加重炎症反应；同时，体内ICAM-1的表达上调，导致局部血管损伤、微循环血流动力学障碍[14]；氧自由基大量蓄积，且清除率低，可加重炎症反应、细胞凋亡等过程，体内SOD及HO-1能调控机体氧化与抗氧化平衡[15]；Bcl-2和Bax比例失衡，使大量促凋亡因子被释放到胞质中，从而和Caspase家族结合，启动内源性细胞凋亡[16-17]；p38MAPK可参与多个过程，从不同方面对脑损伤产生影响[18]；ERK1/2信号通路可介导缺损伤后的炎症反应和神经细胞的坏死及凋亡[19]；P-selectin在脑缺血缺氧发生后，可增加血小板聚集于血管内皮细胞上，对血流造成影响，促进血栓形成[20]。脑缺血后除产生神经功能缺损外，也启动了机体自我保护和修复机制，如BDNF分泌增加，可促进神经元再生、分化及修复[21]；缺血缺氧还可诱导VEGF表达增加，加速建立脑部侧支循环，改善局部血供[22]。实验研究显示，针刺可降低脑缺血大鼠体内的IL-1β、IL-6、NF-κB和IL-8含量，减轻与其相关的各种炎性细胞因子的表达，从而抵抗脑缺血[23]；还可增强脑缺血大鼠体内SOD及HO-1的分泌，降低MDA含量，提高机体对氧自由基清除能力[23-26]；也能通过提高VEGF水平，加速脑缺血后新生血管形成[27]；还可增加BDNF含量来达到修复缺血后神经损伤的目的[28]；通过上调MK、下调CASP3及介导ERK/JNK/P38信号通路来营养神经，减少细胞凋亡[29-30]。

通过GO基因分析及KEGG富集通路分析，发现针刺治疗缺血性脑卒中的关键靶点基因富集信息涉及170条，主要富集于胚胎植入、细胞外空间、蛋白质磷酸化、激活MAPK活性、脂多糖介导的信号通路、细胞对脂多糖的反应、卵巢卵泡发育和对药物的反应，针刺治疗缺血性脑卒中的靶点富集通路有57条，主要与TNF signaling pathway、Pertussis、Tuberculosis、Chagas disease(American trypanosomiasis)、Proteoglycans in cancer、Malaria、Amyotrophic lateral sclerosis(ALS)及NOD-like receptor signaling pathway等相关。通过以上分析，本研究预测针刺很可能通过P38MAPK、MMP-9、TNF-α、ERK-1、IL-1β、IL-6、CASP3及ICAM-1等关键靶点来调节TNF、NOD等信号通路，从而抑制炎症反应、减轻细胞凋亡等过程，达到治疗脑缺血的目的。此外，某一个信号通路可能与多个疾病相关，也为针刺通过该信号通路治疗其他相关疾病提供可能。

中医整体观念认为人作为一个有机整体，针刺通过穴位刺激可调控整个人体网络，可多靶点、多通路和多环节对缺血性脑卒中产生影响，而不是简单的“针刺-效应”两点关系，其产生效应也并不仅仅局限于实验所得的数据中，许多未知的数据需要进一步研究，但目前研究多处于多个穴位对几个靶点的影响作用上，未能系统、整体描述其治病机制，且对单穴治疗缺血性脑卒中的靶点通路的研究也十分缺乏，笔者基于文献研究，借助网络针灸学方法，从网络层次探究针刺治疗缺血性脑卒中的生物学机制，对理解针刺对缺血性脑卒中靶点作用关系提供了重要信息，为进一步探究针刺治疗缺血性脑卒中的基础实验研究提供理论依据。