不同种植体表面性质对雪旺细胞生物学行为影响的研究

王艳颖 宫苹 张健

1.天津市口腔医院（南开大学口腔医院）种植科，天津300041；2.天津市口腔功能重建重点实验室，天津300041；3.口腔疾病研究国家重点实验室国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院种植科，成都610041

骨结合的种植体传递感觉的能力称为骨感知[1]。牙种植体存在感觉功能，对此已达成共识[2]。然而，研究[3]证实种植体的触觉功能与天然牙有所不同。临床研究表明，与天然牙列的触觉功能相比，种植体的主动触觉灵敏度阈值是天然牙的2~3倍[4]，而种植体的被动触觉灵敏度阈值是天然牙的50倍[5]。因此，提高种植体的感觉功能将有助于种植体在口腔内最终实现生理性整合[6]。

天然牙的感觉主要来自于牙周膜的本体感受器，而种植体周围并没有类似天然牙牙周膜的这一特殊结构。近年来的研究[7]证实，在种植术后新形成的骨组织内可以检测到神经纤维，这些有髓和无髓神经纤维分布在靠近种植体螺纹处的哈弗系统中。组织学研究[8]表明，种植体植入后种植体周围的神经纤维是以出芽生长的方式进行再生。周围神经损伤后的修复依赖于轴突的成功再生及雪旺细胞（Schwann cells，SCs）增殖所形成的微环境[9]。因此，在种植体周围神经再生的过程中，神经元和SCs的生物学行为起着决定性的作用。

种植体的表面性质是影响种植体周围组织再生的重要因素。不同种植体表面的微结构和化学成分如何影响神经元和SCs的生物学行为，如何影响外周神经传导，如何促进种植体周围的神经再生，尤其是感觉神经再生等，都成为种植体周围神经支配、感觉功能研究中亟待解决的问题。目前，不同表面处理的种植体，特别是化学改性表面对于SCs和神经元的作用尚未明确。本课题拟探讨不同种植体表面的微结构和化学成分对SCs生物学行为的影响及其机制，为进一步提高种植体的感觉功能提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 不同种植体表面形态的体外检测

本实验选用3种临床常用的种植体表面，分别是光滑处理钛表面（smooth polished，SMO）、大颗粒喷砂酸蚀钛表面（sand-blasted，large grit，acidetched，SLA）、亲水性化学活化大颗粒喷砂酸蚀钛表面（chemically-modified SLA，modSLA）。钛片直径为15 mm，厚度为1 mm（Institute Straumann AG公司，瑞士）。利用扫描电子显微镜（scanning elec‐tron microscope，SEM）观察3种钛片的表面形态。

1.2 SCs的分离、培养、纯化、鉴定

取材于出生1 d 的Sprague-Dawley 乳鼠，用显微器械切取双侧坐骨神经并用磷酸缓冲盐溶液清洗，在体视显微镜下剥离神经外膜，剪成1 mm 的组织块，依次用0.1%Ⅰ型胶原酶和0.25%胰蛋白酶消化。收集细胞悬液进行离心，去上清液，加入含10%胎牛血清的DMEM 培养基，吹打混匀细胞后，接种于培养瓶中培养。接种24 h 后换成含100 mg·L-1G418 的 DMEM 复合培养基培养 3~4 d以除去成纤维细胞。采用S-100蛋白免疫组织化学法进行鉴定。后续实验均采用P2代SCs。

1.3 SCs在不同钛片接种及实验分组

根据检测方法，将SCs按所需的密度分别接种于3种钛片表面。根据钛片的种类不同，每种检测均分为3组：SMO组、SLA组、modSLA组。

1.4 SCs的黏附和形态学观察

SCs 按每孔2×104个接种于钛片表面，钛片置于24 孔板中，每组3 片。培养4 h 和24 h 后，从各组分别取出钛片，经2.5%戊二醛固定，梯度乙醇脱水，临界点干燥，喷金后在SEM 下观察钛片表面的细胞形态。

1.5 SCs的增殖活性检测

SCs按每孔1×104个接种于钛片表面，钛片置于24孔板中，每组3片，分别在接种后的第1、3、5、7 天进行 MTT 检测。每孔加入 MTT （5 mg·mL-1），37 ℃避光孵育3.5 h 后终止。每孔加入二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），37 ℃避光孵育0.5 h。收集每孔样本至96 孔板内，在492 nm 波长下测定各孔吸光度值。

1.6 SCs相关蛋白的表达

SCs 按每孔1×104个接种于钛片表面，钛片置于24 孔板中，每组3 片。在接种后的第3 天和第7天收集培养液，用酶联免疫吸附测定（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒检测神经生长因子（nerve growth factor，NGF）和脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic fac‐tor，BDNF） 含量。

1.7 SCs相关基因的表达

SCs 按每孔2×105个接种于钛片表面，钛片置于6 孔板中，每孔3 片相同钛片。在接种后的第3天和第7 天提取细胞的总RNA，通过实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测NGF和BDNF mRNA表达水平的变化。

1.8 统计分析

实验独立重复3 次.所有实验数据采用SPSS 22.0 软件进行统计分析。实验数据以均数±标准差表示，采用单因素方差分析和Tukey法进行统计分析，取P=0.05为显著性检验水准。

2 结果

2.1 不同处理钛片的表面形态

3 种钛片的大体观见图1，SEM 下观见图2。从图中可见，SMO 钛片表面有大量形状不规则、深度较浅的凹陷；SLA 钛片表面为多级孔状结构，孔洞形状不规则，深浅不一；modSLA钛片干燥后扫描电子显微镜图与SLA钛片一致。

图 1 钛片大体观Fig 1 Gross view of titanium discs

图 2 钛片 SEM ×2 400Fig 2 Titanium discs SEM ×2 400

2.2 SCs的形态学观察

纯化后的P2代SCs呈梭形，两端有细长突起，少数呈三角形，有3个突起，细胞之间以针状突起相互连接（图3 左）。免疫荧光染色可见SCs 标志蛋白S-100表达呈阳性（图3右）。

SEM 显示：接种4 h 后，SCs 在各组中黏附均较好，细胞伸出伪足，呈球形黏附在钛片表面；接种24 h后，SCs伸展成典型的梭形或三角形，以细长突起连接在钛片表面。SCs 在3 种钛片表面均良好黏附和伸展（图4）。

2.3 SCs的增殖活性

各组不同培养时间下SCs 的增殖情况见图5。从图5 可见，随着接种时间的延长，各组OD 值均增大，说明SCs 在各组都可以良好的生长和增殖。第1 天时，各组之间的差异无统计学意义（P>0.05）。第 3、5、7 天时，SMO 组的 OD 值均高于SLA 组和modSLA 组，差异有统计学意义（P<0.05）。第 3 天时，modSLA 组的 OD 值高于 SLA组，差异有统计学意义（P<0.05）；第5 天和第7天时，2 组之间的差异无统计学意义（P>0.05）。这表明，与SLA、modSLA 表面相比，SMO 表面对SCs增殖有明显的促进作用。

2.4 SCs相关蛋白的表达

各组不同培养时间下NGF 和BDNF 的表达见图6。1）NGF的表达：第3天时，SLA组和modS‐LA 组高于 SMO 组 （P<0.05），modSLA 组高于SLA 组（P<0.05）；第7 天时，各组之间差异无统计学意义 （P>0.05）。2） BDNF 的表达：第 3 天时，SLA 组和 modSLA 组高于 SMO 组 （P<0.05），modSLA 组 高 于 SLA 组 （P<0.05）； 第 7 天 时 ，SLA 组和 modSLA 组低于 SMO 组 （P<0.05），SLA组和modSLA组之间差异无统计学意义（P>0.05）。

图 3 SCs 光镜 ×100Fig 3 SCs light microscope ×100

图 4 各组不同时间下的形态学观察 SEM ×2 400Fig 4 Morphological observation of each group under different time SEM ×2 400

2.5 SCs相关基因的表达

各组不同培养时间下NGF 和BDNF mRNA 的表达见图7。1）NGF mRNA 的表达基本与蛋白表达一致。第3 天时（图7A），modSLA 组最高，约为SMO 组的1.8倍 （P<0.05），SLA 组约为SMO 组的 1.4 倍 （P<0.05），modSLA 组高于 SLA 组 （P<0.05）。第7天时（图7B），各组之间差异无统计学意义（P>0.05）。2）BDNF mRNA的表达基本与蛋白表达一致。第3天时（图7C），modSLA组最高，约为 SMO 组的 2 倍 （P<0.05），SLA 组约为 SMO组的1.7倍（P<0.05），modSLA组高于SLA组（P<0.05）。第7天时（图7D），SLA组和modSLA组低于 SMO 组 （P<0.05），SLA 组和modSLA 组之间差异无统计学意义（P>0.05）。这表明，与SMO表面相比，modSLA、SLA表面可促进SCs早期NGF和BDNF mRNA表达，其中modSLA表面的促进作用更显著。

3 讨论

在牙科种植体中，纯钛材料的应用最为广泛。大颗粒喷砂酸蚀是目前钛种植体表面粗糙处理的常用方法。在此基础上经过化学改性，进而形成亲水性的化学活化大颗粒喷砂酸蚀表面。亲水性表面处理不会形成氧化钛膜，具有较高的表面自由能和润湿性，同时避免了碳氢化合物的污染[10-11]。研究[12-13]证实，亲水性表面可以加快血液吸附，吸引骨结合相关蛋白至微孔结构，加快间充质细胞分化为成骨细胞。目前国内外对于亲水性表面的研究大多集中在成骨细胞和骨髓间充质干细胞等成骨相关细胞[14-15]。然而，亲水性表面对于SCs和神经元的作用尚未明确。

图 5 各组不同时间下SCs的增殖情况Fig 5 Cell proliferation of SCs of each group under different time

本实验结果表明，3 种不同表面处理的种植体对于SCs 的黏附和伸展无明显的影响；但是，3 种表面对SCs增殖、早期基因和蛋白表达的影响明显不同。与SLA 和modSLA 表面相比，SMO 表面对于SCs增殖有明显促进作用。此结果表明，对于纯钛材料而言，光滑表面比粗糙表面更利于SCs的增殖。而在神经营养因子（neuronotrophic factors，NTFs） 分 泌 方 面 ， 与 SMO 和 SLA 表 面 相 比 ，modSLA 表面更促进 SCs 早期分泌 NGF 和 BDNF，以及早期NGF 和BDNF 的基因表达。由此可以推断，亲水性表面比非亲水性表面更利于早期NTFs的蛋白分泌和基因表达。这可能是因为大量的血清蛋白会吸附到亲水性表面，对SCs的分泌功能起刺激作用，然而具体分子机制有待进一步深入研究。NGF 和 BDNF 是 SCs 分泌的 2 种重要 NTFs。研究表明，NGF 在体外和体内均能促进感觉神经元的存活和轴突生长[16]，而内源性BDNF是周围神经损伤后神经再生和髓鞘再生所必需的生长因子[17]。

学者[18]探讨了SCs 在机械加工、SLA、羟磷灰石涂层（hydroxyapatite-coated，HA）和钛浆喷涂4 种钛片表面的生长增殖及相关蛋白和基因表达情况，发现HA 涂层对于SCs 生物学功能的促进作用最显著，认为可能与HA 涂层对蛋白质具有很强的吸附特性有关。关于神经元方面的研究，学者[19]在不同钛片上培养大鼠背根神经元细胞，认为与机械加工和SLA 表面相比，电解刻蚀表面更有利于大鼠背根神经元细胞的黏附、细胞间的接触以及细胞外基质的形成。另有学者[20]将胚胎大鼠大脑皮质神经元细胞接种于氧化钛表面，并以玻璃爬片作为对照，发现神经元细胞的生长与分化在2组并无显著差异，但是，神经突的延长在氧化钛表面受到了明显的抑制，树突比轴突的抑制结果更明显。不同种植体表面对SCs和神经元生物学行为的影响及其机制仍有待明确。

图 6 各组不同时间下NGF和BDNF的表达Fig 6 Expression of NGF and BDNF of each group under different time

Wada 等[8]研究表明，种植体周围再生的神经末梢数量在种植体植入后的第1周内逐渐增加。本课题前期动物体内研究[21]也发现，大鼠股骨种植体周围神经纤维数量增加主要发生在种植体植入后的早期，同时这些神经纤维具有周围神经纤维的典型结构，即神经轴突外有SCs完全包绕或者不完全包绕。这些组织学研究结果提示，种植体植入后的早期是种植体周围神经再生的关键时期。研究不同因素，如种植体的表面处理、负载情况、种植时机等，对种植体周围神经再生和外周神经传导的影响，都应重点关注这一关键时期[22-24]。此外，神经轴突再生和SCs的生物学功能在种植体周围神经再生过程中的作用不可替代，仍需进一步深入研究。

图 7 各组不同时间下NGF和BDNF mRNA的表达Fig 7 Expression of NGF and BDNF mRNA of each group under different time

综上，本研究表明，SCs 在3 种不同种植体表面都能良好地黏附、伸展、增殖、表达相关蛋白和基因。其中，SMO 表面对于SCs 增殖有明显促进作用，而modSLA 表面对于SCs 早期NGF 和BDNF的分泌及基因表达有明显促进作用。本研究证实了不同种植体表面性质对SCs的生物学行为影响具有差异。本研究为不同种植体表面性质对种植体周围神经再生和外周神经传导影响的体内研究提供了实验基础和依据。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。