法洛四联症与NOTCH1和JAG1基因3′非编码区变异的相关性研究*

杨小芳，崔芬芬，李元敏，周文君，党国琴，胡 源，路 宁

(兰州大学第一医院心血管外科，兰州 730000)

法洛四联症(TOF) 是一种由于胚胎期心脏流出道发育异常所导致的一类典型的先天性心脏病(CHD)，是最常见的紫绀型CHD，人群中发病率占CHD的7%～10%。TOF 形成的主要因素是在胚胎时期心球与动脉干分割不均匀导致的右心室流出道狭窄，若未行外科手术纠正，90%的患者会在幼年时期死亡[1]。有研究表明，TOF是一类由多基因控制的遗传疾病，具有家族遗传的倾向，其发病是遗传和环境因素共同作用的结果[2-3]。

NOTCH信号通路是CHD发病相关基因的研究重点，参与调控心脏发育的许多关键点，如调节心脏嵴细胞分化和迁移[4]，可导致CHD表现为流出道发育异常，而其分子机制和NOTCH信号通路相关基因突变有关。该通路中两个重要基因NOTCH1和其配体家族的JAG1被发现在胚胎的右心室流出道表达，并且NOTCH1和JAG1基因表达异常可引起心室流出道的发育异常[5-6]。NOTCH1和JAG1 基因突变不仅与Alagille综合征和Adams-Oliver综合征的CHD相关，还与非综合征型的CHD相关，此类患者通常存在心脏流出道及右心室病变[7-11]。所以，NOTCH1和JAG1基因功能突变和CHD有非常密切的关联，两个基因的表达调控，也被认为可以用于临床诊断和遗传分析。目前国内外有关NOTCH信号通路在心脏发育方面的研究主要集中其相关基因的编码区，对于3′非编码区(3′UTR)是否影响CHD的发生研究较少。本研究将进一步探索NOTCH信号通路中NOTCH1 和JAG1 基因3′UTR 存在的变异，探索该区域变异在汉族与回族之间的分布，以及与TOF 发生的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2018年9月至2019年6月就诊于本院的TOF患者，分别选取20 例汉族TOF患者及14例回族TOF患者为汉族与回族病例组。其中，汉族病例组：男11例，女9例，年龄1个月至14岁，平均(7.15±3.53)岁。回族病例组：男9例，女5例；年龄1个月至14岁，平均(7.14±4.87)岁。纳入标准：(1)征得伦理委员会批准和患者及其监护人同意。(2)经影像学手段(心脏超声心动图检查、心导管造影术)确诊为TOF。(3)无其他器官或系统畸形。另外分别选取本院的健康体检者汉族、回族各20名作为汉族与回族对照组，其中，汉族对照组：男11例，女9例；年龄1～15岁，平均(7.85±4.23)岁。回族对照组：男13例，女7例；年龄1～15岁，平均(7.00±3.84)岁。针对检测出的单核苷酸多态性(SNP)，χ2检验分析得出其在对照儿童中的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡。

1.2 方法

1.2.1基因组DNA 提取

每位研究对象采集外周静脉血3～5 mL，采用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，于-80 ℃冰箱保存。基因组DNA采用血液基因组抽提试剂盒(北京天根公司)，提取外周静脉血中淋巴细胞的DNA，样品经琼脂糖电泳检测、测定水平后置于-20 ℃冰箱保存，用于下一步实验。

1.2.2目的DNA片段PCR扩增和测序

提取上述并定量检测的DNA，稀释至50 ng/μL，分别用NOTCH1和JAG1特异性引物(表1)进行扩增。扩增程序分别为：94 ℃预变性5 min，94 ℃ 变性50 s、退火(NOTCH1 为55 ℃、JAG1为50 ℃)50 s、72 ℃ 延伸90 s，共 37个循环，再72 ℃延伸10 min。PCR 产物经电泳检测后，送由北京六合华大基因有限公司进行测序分析。应用Chromas 2.21 软件分析DNA测序结果的峰图，并运用NCBI Blast 软件将测序结果与GenBank 中人NOTCH1和JAG1基因序列进行比对，验证是否存在核苷酸变异。

表1 验证NOTCH1 和JAG1 基因3′UTR 区变异位点的引物

1.2.33′UTR功能预测

采用Targetscan、microRNA.org 和PicTar等3个在线软件，预测NOTCH1或JAG1基因3′UTR区变异位点结合的可能miRNA。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 NOTCH1和JAG1基因3′UTR存在SNP位点

测序结果显示，在病例组与对照组中，NOTCH1基因3′UTR存在3个SNP 位点：126A/G(rs3124591)、410C/T(rs187411222)与753C/G(rs148391832)。JAG1基因3′UTR存在6个SNP位点：402A/G(rs542746042)、486delT(rs3842434)、1132T/G(rs7828)、856-857insT(rs3840074)、1511-1512insT(rs571057258)与1020T/C(rs8708)，见图1。

A、B：NOTCH1 3′UTR 区杂合突变c.*126 A/G 与c.*410 T/C；C：JAG1 3′UTR 区突变c.*486delT；D：JAG1 3′UTR区杂合突变c.*1020 T/C。

2.2 SNP位点在4组间等位基因和基因型的分布

NOTCH1 和JAG1 基因3′UTR 各SNP 位点基因型及等位基因在4 组间的分布，见表2、3。NOTCH1 基因3′UTR 区的3个SNP 位点rs3124591、rs187411222 和rs148391832，三者的等位基因频数在4组对象之间有差异，但由于样本量的问题，经χ2检验计算，三者的不同基因型及等位基因在4组之间差异均无统计学意义(P>0.05)。JAG1 基因3′UTR 区的6个SNP 位点中存在同样现象，6个SNP位点基因型频数在组间存在明显的不同，如rs8708位点，只有回族病例组中存在GG型，而其余3组中均未出现该基因型。经χ2检验计算有5个位点的不同基因型及等位基因在4组对象之间差异均无统计学意义(P>0.05)。位点rs542746042的基因型在4组对象间分布差异均无统计学意义(P>0.05)，而其不同的等位基因在汉族对照组与汉族病例组之间分布差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 NOTCH1基因3′UTR区各SNP 位点基因型及等位基因在4组间的分布[n(%)]

续表2 NOTCH1基因3′UTR 区各SNP 位点基因型及等位基因在4组间的分布[n(%)]

2.3 JAG1基因3′UTR 区有意义的变异位点结合的miRNA

用TargetScan,PicTar和microRNA.org 软件能预测与上文所述汉族对照组与汉族病例组组间分布有差异的SNP 位点(JAG1486del T)结合的miRNA。与该位点结合的miRNA有10种(hsa-miRNA-4753-3p、hsa-miRNA-130b-5p、hsa-miRNA-6818-3p;hsa-miRNA-6895-3p、hsa-miRNA-593-3p、hsa-miRNA-5699-3、hsa-miRNA-4421、hsa-miRNA-6514-3p、hsa-miRNA-6811-3p、hsa-miRNA-214-5p)，除能与变异位点直接结合的miRNA之外，还有一些miRNA能与变异位点周围10 bp以内的序列结合。这些miRNA与靶基因mRNA结合复合物的稳定性可能会受到变异位点的影响，导致靶基因异常表达。

表3 JAG1基因3′UTR区各SNP位点基因型及等位基因在4组间的分布

3 讨 论

NOTCH信号通路是一种在进化上高度保守的信号通路，与心肌细胞分化、心室腔发育、房室间隔形成、瓣膜发育、流出道重塑及动静脉分化等过程的调控密切相关[12-15]。该通路共由4种受体(NOTCH 1～4)和5 种配体(JAG1 和JAG2、DLL1、DLL2、DLL3)组成[16]，其受体及配体编码基因的表达异常，可能对CHD、风湿性心脏病及冠心病的发生、发展具有重要影响[17-20]。该通路中的两个重要基因，NOTCH1和JAG1通常被用于CHD的临床检测和遗传规律分析。miRNA 是一类非编码小RNA，目前发现约有30% 基因受miRNA的调控，其中包括与心脏发育密切相关的基因。近年来，3′UTR作为转录后调控的位点也引起了人们的关注，其可作为调控基因表达的靶点[21]。基因的UTR具有调控序列，miRNA通过与3′UTR结合发挥转录后调控作用，因此，这一区域碱基突变有可能导致疾病的发生[22-24]。所以本研究选取了位于NOTCH1和JAG1 基因3′UTR作为研究对象，试图探索TOF患者在该两个基因的3′UTR是否存在差异。

徐丽娟等[10]研究发现，NOTCH1基因3′UTR的1个新发突变、JAG1基因3′UTR的3个新发突变和2个SNP 位点，人群中的这些变异，提高了其所在区域和一些miRNA序列结合的可能性，最终导致靶基因的表达下调，可能与圆锥动脉干畸形等疾病的发生相关。本研究发现，TOF患者NOTCH1基因3′UTR存在3个SNP位点的杂合突变，JAG1基因3′UTR存在6个SNP位点的杂合突变，虽然这些位点与TOF的关联不明显，但不能排除这些位点在TOF中发挥了一定的作用。但是由于地域限制本研究样本量较少，仅筛查到JAG1基因 3′UTR 的rs542746042位点与TOF具有相关性，该位点突变尚未见相关报道。由此可见，靶基因上游UTR序列的突变，尤其是和种子序列互补结合位点的变异，都会影响miRNA和UTR序列的结合，进而影响靶基因的表达。因此，本研究发现的NOTCH1和JAG1 基因3′UTR突变可能和TOF的发生相关。

3′UTR的SNP位点突变可通过改变mRNA和miRNA之间的亲和力，而达到导致某种疾病易感性增高的作用。应用在线软件进行预测分析后发现有10个可与JAG1基因 3′UTR rs542746042结合的miRNA。目前已发现且在人体中证明可影响心脏发育的miRNA有miRNA-10a、miRNA-19b、miRNA-22、miRNA-155、miRNA-487b、miRNA-2223p等[25]。因此，JAG1可通过与其相关的miRNA结合对心脏的发育产生不良影响，导致TOF的发生。截至目前，仍有大量的miRNA的功能未明确，虽然本研究发现的miRNA尚未有文献证实其作用，但在未来的研究中可行进一步的验证研究。

综上所述，本研究对NOTCH1和JAG1基因3′UTR的变异位点与TOF的相关性进行了探讨，发现JAG1基因3′UTR 的一个突变位点与TOF的发生或患病易感性相关。另外，本研究还发现了NOTCH1和JAG1基因3′UTR的多个变异位点，虽然尚未发现和TOF的相关性，但仍需进一步的验证和论证，以为TOF的产前遗传学咨询、个体化诊断，以及治疗提供遗传基础。