脓毒症与非脓毒症的SIRS关键差异蛋白的筛选与鉴定

覃慧婵，刘凤鸣，谢馥懋

(广西南宁市第一人民医院（广西医科大学第五附属医院）重症医学科, 广西 南宁 530022)

0 引言

脓毒症（Sepsis）是指由感染引起的全身炎症反应综合征，其病情进展快，且通常在短时间内可继发多器官功能障碍，甚至危及患者的生命，近年来，脓毒症的发病率呈逐年升高趋势，且脓毒症病死率高、治疗费用高，目前已对临床工作造成巨大的挑战，然而早期识别脓毒症，尽早开展脓毒症救治能显著降低脓毒症患者的死亡率，减少治疗成本，并能改善预后等[1,2]，然而，在临床工作中，脓毒症与非脓毒症的SIRS的鉴别仍然存在困难，除了根据患者的症状、体征外，目前临床上用于两者鉴别的血清生物学标志物有C反应蛋白（CRP)、白介素类（IL-6、IL-10）及降钙素原（PCT）等，但临床上发现IL-6、IL-10、CRP、PCT等血清生物学标志物用于两者鉴别的敏感性及特异性不高，临床应用价值有限[3,4]。因此，寻找敏感性高、特异性强的能够用于脓毒症与非脓毒症的SIRS鉴别的新型血清生物学标志物是临床医学的研究重点之一。

定量蛋白组学是把一个复杂的混合体系中的所有蛋白质或一个组织基因组表达的全部蛋白质进行精确定量和鉴定的一门学科。目前，定量蛋白组学是继人类全基因组计划完成之后研究的热点之一，是目前蛋白组学研究的前沿领域。对复杂体系中的蛋白质进行相对定量主要有双向凝胶电泳技术联合质谱技术及应用同位素标记联合液相色谱及串联质谱技术。目前对脓毒症的定量蛋白质组学研究主要方法为双向凝胶电泳技术联合质谱技术，Thongboonkerd V 等[5]对腹膜炎引起的脓毒症进行研究，利用双向凝胶电泳技术分离出脓毒症猪模型的血浆，以期发现在脓毒症早期阶段发生改变的血浆蛋白质，该研究共发现1500个蛋白质样点，并选择在脓毒症中表现的36个差异蛋白进行鉴定，利用四极杆飞行时间质谱( quadrupole-time-of-flight MS) 和串联质谱( tandem MS)技术，最终鉴定到脓毒症血浆中的差异蛋白有30个，其中在脓毒症患者中上调的差异蛋白为22个，在脓毒症患者中显著下调的差异蛋白为5个，并通过生物信息学分析，发现这些蛋白主要参与机体氧化应激和炎症反应。

iTRAQ标记联合LC- MS/MS技术是目前为止最先进的定量蛋白质组学技术，可对生理、病理状态下多个时间点的差异蛋白进行定性及定量分析[6]，具有高通量、高定量精度、高分辨率、高重复性等特点[7]。应用iTRAQ标记联合LC- MS/MS技术对脓毒症进行研究的文献极少，国内外共有3篇报道，SU等[8]应用iTRAQ标记联合LC- MS/MS技术对脓毒症及SIRS患者的尿液进行定量蛋白组学研究，共发现表达有显著差异的蛋白34种，并通过生物信息学分析，发现这34种差异蛋白主要参与炎症反应、免疫反应等。

本课题组前期实验通过定量蛋白组学技术iTRAQ标记联合LC-MS/MS筛选出脓毒症与非脓毒症的SIRS患者血清中的差异蛋白，共发现上调的蛋白有311种，下调的蛋白有110种，包括PDIA1、PADI4、GSTA1、MNDA等，并通过生物信息学方法对鉴定到的差异蛋白进行功能分析，发现这些蛋白主要参与炎症反应、免疫调节等生物学过程。上述实验具有高通量、高定量精度等特点，但鉴定到的蛋白存在一定的假阳性，需要进一步验证，本项目采用ELISA对两者的关键差异蛋白PDIA1、GSTA1进行表达验证，以期作为脓毒症与非脓毒症的SIRS鉴别的新型血清生物标志物，进而提高脓毒症的诊疗水平。

1 资料与方法

1.1 标本的收集与保存

收集南宁市第一人民医院2019年01月至2019年06月期间的脓毒症患者、非脓毒症的SIRS患者的血清，所有血清标本均经过患者或家属的知情同意，其入选符合相关诊断标准。并根据性别、年龄进行匹配，两组研究对象在性别、年龄上的差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。所有血清样品均为清晨空腹时使用真空采血管采集，在4℃，3000g的条件下离心10min，收集上清液，冰上分装后-80℃冰箱保存备用。

表1 两组患者基本信息

非脓毒症的SIRS组：30例，年龄20～80岁，非感染因素作用于机体所引起的全身性炎症反应，且具备以下2项或2项以上体征：体温＞38℃或＜36℃,心率＞90次/分，呼吸频率＞20次/分，或PaCO2＜32mmHg，外周血白细胞计数＞12×109/L，或未成熟粒细胞＞0.1。

脓毒症组：30例，年龄20～80岁，由感染引起的全身炎症反应，证实有细菌存在或有高度可疑感染灶，其诊断标准同SIRS。

1.2 差异蛋白表达的验证

应用ELISA对PDIA1、GSTA1进行表达验证，PDIA1、GSTA1两种ELISA试剂盒均购自凡科维。

ELISA实验步骤：

（1）将冻存的标本在冰上解冻后分别取出100μl 备用。

（2）分别取标准品100ul依次加入1排7孔中，1孔只加样品稀释液作为零孔。

（3）酶标板加上盖，37℃反应120分钟。

（4）甩去酶标板内液体，再对着吸水纸拍几下，不洗。

（5）每孔依次加入抗体工作液100μl，37℃反应30分钟。

（6）用洗涤液洗涤3次，每次浸泡1分钟左右，甩去多余液体。

（7）每孔依次加入TMB显色液100μl，37℃避光反应20-25分钟。

（8）每孔依次加入TMB终止液100μl，此时蓝色立即转为黄色。

（9）用酶标仪在450nm波长处测定OD值。

（10）作标准曲线，并根据吸光值计算出相应孔的浓度。

1.3 统计学处理

应用SPSS 17.0统计学软件。呈正态分布的计量资料以（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以频数（n）表示，组间比较采用卡方检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 本课题组前期实验

通过定量蛋白组学技术iTRAQ标记联合LC-MS/MS筛选出脓毒症与非脓毒症的SIRS患者血清中的差异蛋白，共发现上调的蛋白有311种，下调的蛋白有110种，包括PDIA1、PADI4、GSTA1、MNDA等，并通过生物信息学方法对鉴定到的差异蛋白进行功能分析，发现这些蛋白主要参与炎症反应、免疫调节等生物学过程。如图1所示。

图1 生物学过程

2.2 用ELISA分别检测非脓毒症的SIRS组、脓毒症组中的PDIA1、GSTA1表达情况

结果如表2所示，非脓毒症的SIRS组、脓毒症组中的PDIA1、GSTA1比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 两组中PDIA1、GSTA1表达情况

3 讨论

随着我国社会经济的快速发展和医疗服务水平的不断提高，危害人类健康的疾病逐步得到有效控制，但脓毒症仍严重影响患者的生命和生活质量，给社会和家庭带来沉重的精神和经济负担。脓毒症目前已成为严重危害人类健康的疾病之一，是临床上危重症患者的常见并发症，具有发病率高、死亡率高、病情进展快等特点，是临床救治工作中的重点及难点。目前为止，国内外有大量学者对脓毒症的诊治进行了相关的研究，但尚缺乏敏感性及特异性均高且能够用于鉴别脓毒症与非脓毒症的SIRS的生物标志物。

近年来，随着质谱技术的飞速发展，定量蛋白质组学已成为目前研究蛋白质的热点领域，为生命科学的研究提供无可替代的平台，是后基因组时代的重要里程碑。目前常用的定量蛋白质组学研究技术包括以下三种：同位素亲和标记(ICAT)、荧光差异凝胶电泳（DIGE）、同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）[9]。iTRAQ标记联合LC-MS/MS技术是近年来开发的一种新的蛋白质组学定量技术, 具有高通量、高精度、高分辨率、高重复性等无可替代的优势，已逐步替代了DIGE、ICAT等传统蛋白质组学定量技术，已成为目前最理想的定量蛋白质组学技术[10]。

PDIA1（protein disulfide isomerase A1）即蛋白质二硫化异构酶A1，目前为止在国内对该蛋白的研究较少，仅有1篇文献报道，曾亮[11]等研究发现PDIA1在左侧结肠癌的表达显著高于右侧结肠癌，在脓毒症方面尚未见文献报道。国外Kullmann M[12]等研究发现PDIA1可用于评估顺铂在治疗卵巢癌中的疗效，判断预后，但未见PDIA1在脓毒症方面的研究报道。本课题组前期实验发现，PDIA1在脓毒症组的表达显著高于非脓毒症的SIRS组，且PDIA1经过ELISA验证，与蛋白组学的研究结果一致，提示PDIA1有望用于鉴别脓毒症与非脓毒症的SIRS，值得进一步研究。

GSTA1(glutathinoe S-transferase A1)即谷胱甘肽S转移酶A1，能避免体内的一些DNA、蛋白质、脂质等遭受体内产生的活性氧产物带来的的毒性损伤，是人体内发挥分解代谢活性氧产物等有毒物质的II相代谢酶家族的重要成员，进而避免机体遭受氧化应激的损伤[13]。目前国内外对GSTA1报道不多，主要用于肺癌、结肠癌等研究，GSTA1在脓毒症方面国内外均未见报道，本研究发现GSTA1在脓毒症组的表达显著低于非脓毒症的SIRS组，且GSTA1经过ELISA验证，与蛋白组学的研究结果一致，提示GSTA1有望用于鉴别脓毒症与非脓毒症的SIRS，值得进一步研究。

总之，应用iTRAQ标记联合LC-MS/MS技术能很好的进行脓毒症的差异蛋白质组学分析，有利于寻找脓毒症的血清生物标志物，有良好的应用前景。本研究筛选出的差异蛋白PDIA1、GSTA1有望成为潜在的脓毒症血清生物标志物，但因本研究的例数较少，其临床意义有待进一步研究。