益母缩宫颗粒对药物不全流产大鼠血浆FN、LN、ColIV的影响

黄正迎，毛惠，李品英

（1.西南医科大学，四川 泸州 646000；2.西南医科大学附属中医医院，四川 泸州 646000）

0 引言

2017年我国卫生和计划生育统计年鉴的数据表明，2016年中国的人工流产人数达964万[1]。而人工流产中无论是负压吸引术还是药物流产，均会损伤子宫内膜，破坏女性本身的防护屏障，对女性生殖系统及其功能造成潜在危害[2]。近年来运用米非司酮和米索前列醇终止早孕的方法在全世界范围内广泛使用；药物流产作为简便、有效的非手术终止妊娠的方法，被大多数妇女所接受，它还具备病人乐意接受、减少住院次数等优点[3]。药物流产与负压吸引术相比，避免了漏吸、空吸、子宫穿孔、人工流产综合征等并发症，但也会出现不全流产、绒毛蜕膜残留、子宫异常出血等常见并发症，使其在临床应用过程中受到一定的限制，研究缩短和减少药物流产后子宫异常出血的治疗方法显得尤为重要。我院院内制剂益母缩宫颗粒广泛用于药物流产、顺产后，前期临床研究表明其可通过调节内分泌激素、改善凝血功能来帮助子宫内膜修复、促进子宫复旧从而减少药物流产后子宫异常出血[4-6]，但其作用机制仍不十分明确。本次研究通过建立米非司酮+米索前列醇建立药物不全流产大鼠模型，经益母缩宫颗粒干预后，测定大鼠血浆中FN、LN、ColIV的值，从而探讨益母缩宫颗粒参与药物流产后子宫内膜修复、减少子宫异常出血的作用机制与细胞外基质的关系。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

SPF级性成熟SD大鼠，雄性大鼠25只，雌性大鼠60只，均由西南医科大学实验动物中心提供；雌性大鼠体重220～260g，雄性大鼠体重250～280g，许可证号 SCXK（川）2018-17。购买后分笼适应性喂养1周，大鼠全天自由饮水，繁殖饲料喂养；培育室温度21℃-22℃，湿度60%-80%，人工光照（12h昼，12h夜）；均饲养于西南医科大学实验动物中心（许可证号SYXK（川）2018-065）。

1.2 实验药物

益母缩宫颗粒，10g/袋，批号：20191119,西南医科大学附属中医医院。

米非司酮，25 mg/片，批号：432005041，华润紫竹药业有限公司。

米索前列醇，0.2 mg/片，批号：43200304，华润紫竹药业有限公司。

缩宫素，1mL/支，1mL：10单位，批号21908013，南京新百药业有限公司。

注射用苯巴比妥钠，0.1g/瓶，批号190503，上海上药新亚药业有限公司，使用时用生理盐水配制成10%溶液，按50mg/Kg腹腔注射麻醉。

所有灌胃药物均根据人鼠剂量比换算成大鼠灌胃剂量，成人体重按60 kg计算。

1.3 主要试剂及仪器

试剂：Rat FN ELISA KIT，货号：ZC-37348，规格：96孔/盒，上海茁彩生物科技有限公司生产；Rat LN ELISA KIT，货号：ZC-36446，规格：96孔/盒，上海茁彩生物科技有限公司生产；Rat Col IV ELISA KIT，货号：ZC-36018，规格：96孔/盒，上海茁彩生物科技有限公司生产。

仪器与耗材：计算机，型号 TFT185W80PS，冠捷显示科技有限公司生产；酶标仪，型号pectraMAX Plus384，美谷分子仪器有限公司生产；优普超纯水制造系统，型号 UPH-Ⅱ-10T，成都超纯科技有限公司生产；高速微量离心机，型号：5424GI174620，德国艾本德股份有限公司；电子恒温水浴锅，型号DZKW-4，北京中兴伟业仪器有限公司生产；手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器，型号SYQ-DSX-280B，上海申安医疗器械厂生产；移液枪，规格，1000μL、200μL、20μL、10μL、2μL，大龙兴创实验仪器（北京）有限公司生产；枪头，规格，1000μL、200μL、20μL，美国Axygen公司生产； EP管，规格：1.5mL、0.2mL、100μL，美国Axygen公司生产。

2 实验方法及步骤

2.1 实验动物造模、分组及给药

参照王晓东[7]造模法制备药物不全流产大鼠模型，选择SPF级成熟雌性大鼠60只，成熟雄性大鼠25只，适应性喂养7天后，随机挑选10只未合笼雌性大鼠作为空白组。其余大鼠按照雌雄2：1比例于下午18时合笼，次日晨8时检查阴道涂片，发现有精子者为妊娠第1天。若雌鼠未受孕，则继续于下午18时与雄鼠按2:1合笼，连续合笼3-5天，然后换批次继续合笼。最终受孕大鼠，均于妊娠第7天早上8时灌服米非司酮（8.3mg/kg），下午18时灌服米索前列醇（100ug/kg），并在雌性大鼠阴道内置入一个清洁棉球，次日检查大鼠阴道内棉球，查见血迹则基本认为造模成功。

将最终造模成功的48只大鼠随机分为5组，分别为：模型组、缩宫素对照组（缩宫素组）、益母缩宫颗粒低剂量组（低剂量组）、益母缩宫颗粒中剂量组（中剂量组）、益母缩宫颗粒高剂量组（高剂量组），其中高剂量组和中剂量组每组9只，其余各组每组10只。上诉各组大鼠分别于妊娠第8天开始做如下处理：模型组：灌胃动物饮用水（NS）连续7天（每只灌胃饮用水1mL/（100g.d））；缩宫素对照组：连续3天肌注缩宫素0.9U/（kg.d）。益母缩宫颗粒各组：灌胃益母缩宫颗粒，低剂量组1.562g/（kg.d），中剂量组3.125g/（kg.d）、高剂量组6.25g/（kg.d）连续7天。而空白组大鼠则于妊娠第7天开始，灌胃实验中心实验动物饮用水1mL/（100g.d），连续8天。大鼠按1mL/100g计算灌胃量。

2.2 动物标本的采集

各组大鼠于妊娠第15天时，予以10%苯巴比妥钠腹腔注射麻醉。解剖大鼠，找到腹主动脉，抽取血液约5mL，静置半小时，采集上层血清离心机离心（3200r，12min），以无菌吸管吸取上层血清约2mL，冻存于-80℃冰箱，以待后续检验。

2.3 指标检测方法与步骤

2.3.1 指标检测方法

本实验将FN、LN、ColIV抗体包被于96孔微孔板中，制成固相载体，向微孔中分别加入标准品或者样本，其中的FN、LN、ColIV连接于固相载体上的抗体结合，然后加入辣根过氧化物酶标记的抗体，将未结合的抗体洗净后再次加入TMB底物显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的FN、LN、ColIV呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

2.3.2 具体步骤

①复温：将所有试剂逐渐平衡至室温。②加样：空白孔，空白对照孔不加样品，只加显色剂A、B和终止液用于调零；标准品孔，加入配好的标准品50μL，然后加入辣根过氧化物酶100μL；待测样品孔，加入样本50μL，然后辣根过氧化物酶100μL，盖上封板膜，轻轻振荡混匀，37℃温育60min。③配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。④洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置1min后弃去，如此重复5次，拍干。⑤显色：每孔先加入底物液A50μL，再加入底物液B50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15min。⑥终止：每孔加终止液50μL，终止反应。在15min内，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。

2.4 统计学方法

实验数据资料用SPSS 25.0统计软件进行统计分析，所有资料均为数值变量且符合正态性及方差齐，使用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行数据统计，组间比较用LSD-t法进行分析，所有数值以均数±标准差（±s）表示。P＜0.05则认为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 妊娠第15天时，各组大鼠血浆FN、LN的水平变化

表1 各组大鼠血清中FN、LN浓度的变化（±SD）

与模型组相比，空白组、缩宫素组大鼠血浆FN、LN水平明显降低，有明显统计学差异（P＜0.01）；中剂量组、高剂量组血浆FN、LN降低，有统计学差异（P＜0.05）；而低剂量组与模型组相比，有下降趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

与空白组相比，模型组、低剂量组血浆FN、LN水平升高，统计学差异明显（P＜0.01）；缩宫素组、中剂量组、高剂量组血浆FN、LN水平有上升趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表1。

3.2 妊娠第15天时，各组大鼠血浆ColIV的水平变化

表2 各组大鼠血浆中Col IV浓度的变化（±SD）

与模型组相比，空白组、缩宫素组、中剂量组、高剂量组大鼠血浆Col IV水平降低，有明显统计学差异（P＜0.01）；而低剂量组有下降趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

与空白组相比，模型组、低剂量组血浆Col IV水平上升，差异明显（P＜0.01），而缩宫素组、中剂量组、高剂量组与空白组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表2。

4 讨论

纤维连接蛋白(fibronectin,FN)、层粘连蛋白(laminin,LN)、胶原纤维、糖蛋白等是组成细胞外基质（extraceliular mat riX，ECM）的主要成分。生理状态下，ECM 处于不断生成和降解的动态平衡中,影响着细胞的增殖、分化、粘附、形态发生等过程；若ECM过度生成则会导致组织器官的纤维化[8-9]。子宫内膜周期性的脱落伴随出血、止血和修复、增殖、分化等过程也涉及到ECM的水解[10]。

FN主要分为血浆纤维连接蛋白和细胞纤维连接蛋白，是一种非胶原糖蛋白。血浆纤维连接蛋白具有促进组织修复、增加细胞间连接、调节细胞分裂和增殖等作用；细胞纤维连接蛋白在细胞之间起连接作用，影响细胞的迁移与分化[11]。FN在子宫组织中主要分布于绒毛上皮基膜、绒毛间质、蜕膜间质及滋养细胞中，它在月经周期中主要参与子宫内膜的脱落和修复、内膜脱膜化及胚胎着床等各个方面，且具有重大意义[12-13]。

层粘连蛋白(laminin,LN)存在于基底膜中，也是一种特有的非胶原糖蛋白；它与Ⅳ型胶原一起构成基膜, 能共同连接和维持组织的形态。LN是胚胎发育中最早出现的ECM成分，它和FN在子宫内膜上的分布相似，是蜕膜细胞生长发育所需微环境的重要物质，在细胞生长、分化、增殖及细胞黏附中起关键作用[14-15]。而IV型胶原呈薄网状分布于多种组织基底膜中，属于基膜胶原；它可使组织结构更完整，为其他生物大分子的组装提供框架[16-17]。

相关研究发现，米非司酮及米索前列醇可以使蜕膜组织中FN、LN的水平较正常妊娠时明显下降，使胚胎与子宫内膜的联系中断，从而抑制胚胎的早期发育；而ColIV的下降使得其对胚胎的支持连接作用也消失，使胚胎从子宫内膜上脱落，排出体外[18]。

药物不全流产是指口服米非司酮及米索前列醇后，宫内妊娠组织排出不全，蜕膜组织及绒毛组织残留宫腔的一种并发症，其危害主要是长期异常子宫出血、继发感染、月经紊乱等。本研究结果显示，中剂量组、高剂量组及缩宫素组均可降低药物不全流产大鼠血浆中FN、LN的水平，其中缩宫素下降效果明显；缩宫素组、中剂量组及高剂量组均可降低大鼠血浆中Col IV的水平，且三组差异均较明显。药物不全流产后高水平的FN、LN、ColIV使得蜕膜绒毛组织与子宫内膜紧密黏附，而残留的蜕膜绒毛组织使得子宫收缩乏力，持续异常出血；而缩宫素、益母缩宫颗粒通过降低血浆中FN、LN、ColIV的水平，减少蜕膜绒毛组织与子宫内膜的黏附，从而使蜕膜绒毛组织排出体外，减少子宫异常出血。

综上所述，益母缩宫颗粒减少药物不全流产后子宫异常出血的机制，可能是通过降低药物不全流产大鼠血浆FN、LN及ColIV的表达，促进残留绒毛、蜕膜组织的排出，从而加速受损子宫内膜基质的修复。但益母缩宫颗粒的此种作用具体通过什么途径调节，仍待下一步研究讨论。