聊城地区新德里金属β-内酰胺酶菌株的分子流行病学及感染危险因素研究

田金静 康亚丽 路秀芳 任更朴

山东第一医科大学附属聊城二院 山东省聊城市第二人民医院检验科，山东聊城 252600

随着碳青霉烯类抗生素药物的广泛应用，临床耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌（carbapenem resistant enterobacteriaceae，CRE）日益增多[1-2]。现已证明，产新德里金属β-内酰胺酶（New Delhi metalloβ-lactamases，NDM）能够水解除单β-内酰胺类之外所有β-内酰胺类抗生素，是介导CRE产生的主要因素之一[3]。研究显示[4-5]，CRE中NDM基因型检出率较低，且对NDM阳性菌株感染的危险因素及预后的报道极少，尤其是聊城地区对其NDM阳性菌株分子流行病学及感染危险因素的研究仍为空白[6]。因此，本研究收集符合要求的2014年1月至2018年12月临床分离的非重复的碳青霉烯类耐药的肠杆菌科细菌为研究对象进行研究。探讨聊城地区新德里金属β-内酰胺酶菌株的分子流行病学及感染危险因素。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 收集目标菌株

经过我院医学伦理委员会批准实施本次研究。采用分层抽样法从聊城地区2014年1月至2018年12月15所医院中抽取样本5689例，其中，临床标本中分离的碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌共112份。112份样本中，其中男58例，女54例，年龄18～70岁，平均（46.36±11.65）岁。所有菌株均经过Vitek 2-Compact细菌鉴定分析仪（法国生物梅里埃）进行鉴定，鉴定卡片为GN卡（法国生物梅里埃），药敏试验采用琼脂稀释法，严格按照2018年CLSI的标准进行药敏试验和结果判定。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922。

纳入标准：①均符合碳青霉烯类耐药的肠杆菌科细菌的质控标准；②属地均位于山东省聊城地区的样本；③符合制备和保存标准的标准。

1.2 耐药表型及基因型检测

碳青霉烯酶表型确证试验采用改良Hodge试验、ETP-EDTA协同试验及mCIM试验。采用PCR法扩增以下碳青霉烯酶基因，包括Ambler A组酶基因（blaKPC、blaNMC、biaSME、blalMI、blaGES），Ambler B组 酶 基 因（blaIMP、blaVIM、blaSPM、blaGIM、blaSIM、blaNDM），Ambler D组 酶 基 因（blaOXA），其他β-内酰胺酶基因（blaCTX-M）。阳性和阴性质控样本跟随每批PCR试验。使用ABI 3730X自动测序仪进行基因测序（北京博迈德生物工程公司），其测序结果至Genbank数据库（http//www.ncbi.nlm.nih.gov/）使用BLAST软件比对以确定β-内酰胺酶基因型。采用脉冲场凝胶电泳（PFGE）及多位点序列分型（MLST）技术确定其等位基因谱及菌株序列型（ST型）。

1.3 病历信息收集

采用回顾性研究的方法，制作调查表后查阅NDM阳性菌株感染的患者出院病历，调查内容包括以下观察指标：患者的住院科室、姓名、性别、年龄、住院时间、抗生素使用史、基础疾病、危险因素、临床结局等资料。

1.4 技术路线

见图1。

图1 技术路线

1.5 统计学处理

数据处理使用SPSS 21.0统计分析软件完成。计量资料以（）表示，采用t检验，计数资料以[n（%）]表示，采用Fisher确切概率法检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。多因素分析采用多因素Logistic回归分析，计算优势比（OR）和95%可信区间。

2 结果

2.1 感染危险单因素分析

采用分层抽样法从聊城地区2014年1月至2018年12月期间15所医院中抽取样本5689例，其中，临床标本中分离的碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌共112份，发生率1.97%。可见，不同危重度（符合并入住ICU）、合并基础疾病（2种及以上）、存在侵入性操作、使用糖皮质激素、使用免疫抑制剂药物是碳青霉烯类耐药情况下碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌感染率差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 感染危险单因素分析[n（%），n=5689]

2.2 核心变量赋值表变量赋值

核心变量赋值表变量赋值见表2。

表2 变量赋值表

2.3 感染危险多因素分析

将危重度合并基础疾病情况、是否侵入性操作、是否使用糖皮质激素、是否使用免疫抑制剂药物纳入Logistic回归分析模型，结果显示，危重度（符合并入住ICU）、合并基础疾病（2种及以上）、存在侵入性操作、使用糖皮质激素、使用免疫抑制剂药物是碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌感染的独立危险因素（P＜0.05），见表3。

2.4 药敏试验结果

26株产NDM肠杆菌科细菌呈现多重耐药性，其中7株对亚胺培南耐药、8株对厄他培南耐药、6株对美罗培南耐药，5株对3种药物都敏感。

2.5 耐药基因检测结果

PCR结果显示，26株产NDM的大肠埃希菌分为4个基因型，其中9株D型，8株B型，5株C型，4株A型。见表4。

3 讨论

自2010年，我国浙江地区首次报道产NDM-1酶肺炎克雷伯菌以来，全国各地区均有所报道，发生率呈逐年上升趋势[7]。据2013年的报道，我国主要的碳青霉烯酶是KPC-2，约占70.6%，一部分CRE由IMP-4等碳青霉烯酶引起，NDM基因导致的CRE发生率各地区、肠杆菌科各种属间差别较大[8]。2014年山东地区首次报道新生儿科病房暴发产NDM-1肺炎克雷伯菌院内感染。尤其需要重视的是碳青霉烯类耐药基因通常位于可克隆传播和水平传播的质粒上，因此容易引起院内肠杆菌科细菌间耐药性的广泛传播[9]。有学者推测我国的NDM阳性流行株主要源于本土，且携带NDM耐药质粒的鲍曼不动杆菌在NDM的播散中起到了重要作用[10]。

到目前为止，法国、德国、西班牙、瑞典、日本和中国香港、台湾、大陆等地均已发现携带NDM-l的菌株。据患者感染情况及细菌本身特点，专家认为产NDM-1细菌可能主要通过密切接触感染。易感人群包括疾病危重、入住重症监护室、长期使用抗菌药物、基础疾病、侵入性操作、糖皮质激素或免疫抑制剂药物使用等患者[11]。感染后患者临床表现与敏感细菌没有差别，但对一般抗菌治疗无效。因此，我们需要通过对聊城地区住院患者临床分离的碳青霉烯酶耐药基因分型进行研究，以明确本地区以何种基因型为主，进一步研究本地区CRE中的NDM菌株流行病学情况，从而提高抗感染经验性用药的有效性，控制其传播，减少NDM菌株感染的发生，为制定预防和控制CRE院内感染的策略和措施提供科学的依据[12-13]。

表3 感染多因素Logistic回归分析结果

随着碳青霉烯类抗生素在临床上广泛使用，肠杆菌科细菌的耐药性问题日益严重。产碳青霉烯酶是耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌（CRE）主要的耐药机制，其中，新德里1型金属β-内酰胺酶（NDM-1）是一种新型碳青霉烯酶，耐药表型和传播机制不同于其他碳青霉烯酶[14]。2016年中国一次大规模调查表明耐药机制已发生变化，每个地区有所不同，NDM金属酶在碳青霉烯酶中占据越来越大的比例。

表4 耐药基因检测结果

研究发现，NDM酶在聊城地区分离的CRE中出现高发流行，《产NDM泛耐药肠杆菌科细菌感染诊疗指南》强调，下一步要加强对产NDM细菌的监测及抗菌药物合理使用管理。据有关文献报道，肠杆菌科细菌对碳青霉烯类药物产生的耐药机制不同，临床用药也有所不同，如新药头孢他啶/阿维巴坦的上市给革兰阴性细菌感染的治疗带了新的选择，但遗憾的是它对A类和C类具有良好活性，但对于B类（NDM、IMP）没有效果[15]。

本研究结果显示，5689例样本中，临床标本中分离的碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌共112份，发生率1.97%。可见，不同危重度、合并基础疾病、存在侵入性操作、使用糖皮质激素、使用免疫抑制剂药物是碳青霉烯类耐药情况下碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌感染率差异有统计学意义（P＜0.05）。Logistic回归分析模型，结果显示，危重度（符合并入住ICU）、合并基础疾病（2种及以上）、存在侵入性操作、使用糖皮质激素、使用免疫抑制剂药物是碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌感染的独立危险因素（OR=1.977、1.558、1.103、1.078、1.770，P＜0.05），26株产NDM肠杆菌科细菌呈现多重耐药性，其中7株对亚胺培南耐药、8株对厄他培南耐药、6株对美罗培南耐药，5株对3种药物都敏感。PCR结果显示，26株产NDM的大肠埃希菌分为4个基因型，其中9株D型，8株B型，5株C型，4株A型。

综上所述，金属β-内酰胺酶的大肠埃希菌呈现出流行爆发的趋势，并呈现出多重耐药的特点，且可通过质粒在菌种间进行水平传播。因此，我们应加强对聊城地区CRE的分子流行病学及NDM菌株的流行趋势的研究，以指导临床更加快速的选择有效的抗菌药物，提高患者的治愈率，为今后控制CRE的感染以及暴发流行提供依据。