免疫组化检测乳腺癌组织中RHBDF1、ADAM17和EGFR的表达

李昊鑫，司晓闯，姜涵译，张雪鹏

（华北理工大学附属医院 肿瘤外科，河北 唐山）

0 引言

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，人类菱形蛋白家族基因 1（Rhomboid Family-1 Gene, RHBDF1）、解聚素 -金属蛋 白 酶 17（A Disintegrin and Metalloproteinase, ADAM17）和表皮生长因子受体（Epithelial Growth Factor Receptor, EGFR）作为肿瘤标记物在乳腺癌组织表达状况已见报道[1-2]，但三者同时检测并且探讨其相关性的研究尚罕见报导。本研究通过免疫组化法观察RHBDF1、ADAM17和EGFR蛋白在癌旁组织、纤维腺瘤和乳腺癌组织中的表达，分析它们与乳腺癌临床病理特征的关系及三者的相关性，探讨三者在乳腺癌发生、发展中可能的作用。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选取2019年1月1日至2020年8月31日华北理工大学附属医院病理科存档的乳腺组织标本。纳入标准：①经病理诊断为乳腺癌或纤维腺瘤的女性患者；②初次诊治且临床资料完整；③术前均未接受化疗、放疗。排除标准：①伴自身免疫性疾病、免疫缺陷病及其他恶性肿瘤者；②远处转移。根据纳入、排除标准，本研究共纳入182例乳腺癌及190例乳腺纤维腺瘤患者。乳腺癌组中，采用随机抽样的方法抽取64例乳腺癌，患者年龄 30～77岁，平均（45.54±6.86）岁；乳腺纤维腺瘤组中，采用随机抽样的方法抽取30例乳腺纤维腺瘤，患者年龄24～48岁，平均（34.68±9.57）岁。两组患者年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。另随机抽样选取乳腺癌组患者经病理学检查未被浸润的癌旁组织（肿瘤边缘＞5 cm区域）作为癌旁乳腺组（30例）。

1.2 主要试剂

RHBDF1抗体购自Eter Life生物科技公司，ADAM17、EGFR抗体购自武汉三鹰技术公司，DAB酶底物显色试剂盒购自北京中杉金桥生物公司。

1.3 实验方法

取厚度为4 μm的切片组织进行脱蜡，并应用阶梯酒精进行水化、冲洗，后进行抗原修复、消除过氧化物酶活性，再次洗涤切片组织，分别滴加一抗RHBDF1（1:100）、ADAM17（1:100）、EGFR（1:500），4 ℃过夜。次日加二抗（HRP）室温孵育，并行DAB反应显色、苏木素复染，最后封片，于显微镜下判读结果。

1.4 免疫组化结果判定

显微镜下RHBDF1、ADAM17、EGFR阳性表达在细胞质中为棕色颗粒状。低倍镜观察细胞染色分布情况，高倍镜观察细胞形态及染色定位，由2位经验丰富的病理学高年资医生采取双盲法在400倍镜下随机选择5个不重复的视野，记录阳性细胞数并取平均值，阳性细胞比例评分：全部阴性为0分，阳性细胞≤10%（1分），10%＜阳性细胞≤50%（2分），50%＜阳性细胞≤75%（3分），阳性细胞＞75%（4分）。根据细胞染色强度判断：无着色则为阴性（0分），淡黄色为弱阳性（1分），棕黄色为阳性（2分），棕褐色为强阳性（3分）。统计分析时根据二者相乘判定结果：阴性≤1分、阳性＞1分。

1.5 统计学分析

应用SPSS 22.0统计学软件中，计量资料采用t检验，计数资料采用卡方检，相关性检验采用Spearman等级相关分析，检验水准α=0.01，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RHBDF1、ADAM17、EGFR蛋白在不同乳腺组织中的表达

免疫组织结果显示：RHBDF1在癌旁组织、纤维腺瘤、乳腺癌组织中阳性表达率分别为13.3%（4/30）、23.3%（7/30）、82.8%（53/64）；ADAM17在癌旁组织、纤维腺瘤、乳腺癌组织中阳性表达率分别为 10.0%（3/30）、20.0（6/30）、76.6%（49/64）；EGFR在癌旁组织、纤维腺瘤、乳腺癌组织中阳性表达率分别为 13.3%（4/30）、16.7%（5/30）、79.7%（51/64）。乳腺癌组织中RHBDF1、ADAM17、EGFR阳性表达率显著高于纤维腺瘤及癌旁组织，差异具有统计学意义（P＜0.05），见图1。

图1 RHBDF1、ADAM17、EGFR在癌旁组织、纤维腺瘤和乳腺癌中表达的免疫组化检测（SP×400）

2.2 乳腺癌组织中RHBDF1、ADAM17、EGFR蛋白的表达与临床病理特征的关系

结果显示乳腺癌组织中RHBDF1、ADAM17、EGFR蛋白的表达阳性率与乳腺癌病理类型、组织学分级均有相关关系（P＜0.05），而与患者年龄、临床分期、ER、PR受体等无明显相关性（P＞0.05），见表1。

2.3 乳腺癌组织中RHBDF1、ADAM17、EGFR蛋白表达的相关关系

乳腺癌标本中，RHBDF1、ADAM17、EGFR蛋白的表达同为阳性的有48例，共同阴性的有8例，RHBDF1与ADAM17的相关系数r=0.712，P=0.000；RHBDF1与 EGFR的相关系数r=0.751，P=0.000；ADAM17与EGFR的相关系数r=0.785，P=0.000；表明 RHBDF1、ADAM17、EGFR 的蛋白表达具有相关性，见表2。

3 讨论

乳腺癌是发生在乳腺上皮组织的恶性肿瘤，病因复杂，多认为与基因突变等因素相关，具有较高的发病率。在本研究中我们通过对人乳腺癌旁组织、纤维腺瘤、乳腺癌中RHBDF1、ADAM17、EGFR蛋白表达水平进行检测，发现从癌旁组织到纤维腺瘤和乳腺癌，RHBDF1、ADAM17、EGFR蛋白表达的阳性率均呈逐渐升高趋势，并且在乳腺癌中的表达显著高于癌旁组织和纤维腺瘤，提示乳腺癌的发生可能与RHBDF1、ADAM17、EGFR蛋白的高表达有关。此外还发现，乳腺癌中RHBDF1、ADAM17、EGFR蛋白表达水平与病理类型、组织学分级有显著的相关性，进一步提示一定程度高表达的RHBDF1、ADAM17、EGFR蛋白可能加剧了乳腺癌浸润，预后不良。

表1 RHBDF1、ADAM17、EGFR的表达与乳腺癌患者临床病理特征的关系（n）

表2 RHBDF1、ADAM17和EGFR蛋白表达的Spearman相关性分析

RHBDF1是缺乏蛋白酶活性的菱形家族的成员，它参与生长信号转导的调节蛋白，研究发现RHBDF1在结直肠癌、食道癌以及宫颈癌等恶性肿瘤中，RHBDF1基因存在着过度表达，沉默RHBDF1基因表达后，可以诱导细胞发生凋亡以及抑制细胞生长[3-4]。有研究证明，RHBDF1蛋白在乳腺癌中高表达，但在正常的乳腺组织中几乎不存在或以低水平存在，在侵袭性导管癌的临床标本中，RHBDF1 mRNA水平显着升高，并且在许多人类乳腺癌细胞系中蛋白质水平更高，而RHBDF1基因沉默会导致乳腺癌细胞的凋亡或自噬，并抑制肿瘤的生长[5-6]。RHBDF1调控着ADAM17的成熟和功能,而且也是激活EGFR所需的运输机制的关键要素,而ADAM17也是EGFR信号传导的关节调节剂[7-8]。