美洲锦鳚抗冻蛋白的表达与特性分析

陈 莹, 赵庆春, 吴 琼, 胡 北, 许子华

(中国人民解放军北部战区总医院 药学部实验室， 辽宁 沈阳 110000)

0 引言

【研究意义】我国高寒地域广泛，涵盖东北、西北、华北等，人体长时间暴露在低温环境中极易导致寒冷损伤，急需增强抵御寒冷的能力和提高寒冷情况下的作业能力[1]。抗冻蛋白是一类能抑制冰晶生长或抑制重结晶的蛋白质，主要应用于农业、医学、食品、工业等领域，医学方面的应用主要集中在细胞及器官的超低温保存方面，若能拓展至冻伤防治领域，将会是一大突破，对寒冷损伤的预防研究具有重大意义[2-3]。【前人研究进展】生活在低温环境下的鱼类为了适应生存环境，在长期进化中产生了一种能抑制冰晶生长或抑制重结晶的蛋白质，即抗冻蛋白(antifreeze peoteins,AFPs)。抗冻蛋白最早在1969年由Devries在极区海鱼血液中发现，目前已证明AFPs普遍存在于鱼类、植物、昆虫、细菌和真菌中[1-3]。抗冻蛋白能在结冰或亚结冰条件下保护生物体不受伤害，海水的冰点大约在-1.8℃，由于导热介质的不同，海水中的温度变化比陆地小。针对抗冻蛋白的作用机制研究，学者们提出了多种假说，大多数研究者比较接受Raymond在1977年提出的吸附抑制学说，该学说认为在低温条件下，AFPs具有选择吸附性，首先结合在冰晶生长的表面，使冰晶停止生长，而未被AFPs覆盖的区域晶体则沿着平面逐渐向前推进，最终形成圆形的表面，使其表面曲率增加，进而增加晶体表面积，从而影响晶体生长[4-8]。【研究切入点】基于仿生学原理，利用分子生物学技术，结合生物信息学分析，研究美洲锦鳚抗冻蛋的表达与特性，为探索寒冷损伤防治的新方法奠定理论基础。【拟解决的关键问题】美洲锦鳚体内的抗冻蛋白为Ⅲ型抗冻蛋白，研究低温诱导获得可溶性AFPs的诱导条件，通过生物信息学分析构建美洲锦鳚抗冻蛋的低温表达系统，研究鱼类抗冻蛋白的特征特性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 载体和菌株 PMD18T-AFP质粒、感受态大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株DH5α、BL21(DE3)均为中国人民解放军北部战区总医院药学部实验室保藏。

1.1.2 主要试剂 PCR扩增试剂、限制性内切酶Xho I、Nde I，T4 DNA连接酶，Taq酶以及DL2000 DNA marker等购自宝生物工程(大连)公司，异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、氨苄青霉素(Amp+)、超低分子量蛋白marker、Bradford蛋白浓度测定试剂盒、Tricine-SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、考马斯亮蓝快速染色液均购自Solarbio公司。

1.2 方法

1.2.1 构建表达载体 设计引物：F: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'，R: 5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'。通过PCR从PMD18T-His6-AFP质粒上获取目的基因，利用Xho Ⅰ、VNdeⅠ限制性内切酶双酶切，得到的酶切片段用T4 DNA连接酶与pET22b载体连接，使目的基因克隆至pET-22b载体。将重组质粒转化E.coli BL21(DE3)的感受态细胞，并涂布于含有氨苄青霉素(Amp+)的LB固体培养基上，37℃倒置培养。通过菌落PCR鉴定，扩增所得的片段经琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出阳性克隆的单菌落，并送至金唯智生物科技有限公司进行测序。

1.2.2 诱导表达 将重组菌株接种至含Amp+的新鲜LB液体培养基中，恒温震荡培养至OD600为0.6～0.8，考察不同诱导温度(18℃，28℃，37℃)及不同终浓度诱导剂(IPTG)(0 mmol/L, 0.1 mmol/L，0.2 mmol/L，0.4 mmol/L)对目的蛋白表达量的影响，优化诱导条件。培养结束后，离心去除培养基，收集菌体，超声破碎后离心，吸取上清液，得到可溶性蛋白，通过 Elisa分析蛋白表达情况，确定最佳诱导条件。

1.2.3 蛋白纯化 经扩大培养后收集菌体，超声破碎的上清液通过Chelating Sepharose Fast Flow层析对含有His-tag的目的蛋白进行纯化，将样品以0.8 mL/min的流速上样，再用含不同浓度咪唑的缓冲液洗脱，收集不同条件下的洗脱液进行Tricine-SDS-PAGE分析。

1.2.4 质谱(MALDI-TOF/TOF)鉴定 从Tricine-SDS-PAGE分析的胶条上切取目的蛋白，经处理后通过MALDI-TOF/TOF串联质谱仪检测，采用自动获取数据及正离子模式进行数据采集，将一级与二级质谱数据整合，并使用GPS 3.6(Applied Biosystems)和Mascot 2.3(Matrix Science)对数据进行全面分析和蛋白鉴定。

1.2.5 生物信息学分析 从基因数据库(GenBank/EMBL)中获取各种鱼类抗冻蛋白的序列信息，用MEGA 7.0 进行多序列比对，用邻接法(Neighbor-joining)构建系统进化树。

1.2.6 性质分析 根据结构、活性、作用机制等的差异，对几种鱼类抗冻蛋白的性质进行比较分析。

2 结果与分析

2.1 载体构建

培养后的菌落通过PCR鉴定(图1)，筛选出的阳性单菌落序列与GeneBank中鱼类抗冻蛋白的序列比对一致。

注：M为DNA marker，1～5为AFP的PCR产物。

2.2 诱导表达

从图2看出，加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG，诱导温度为18℃时，目的蛋白表达量最高。

图2 不同诱导温度及诱导剂不同浓度处理目的蛋白的表达量

2.3 蛋白分离纯化

电泳结果(图3)显示，最终纯化的蛋白仅有1条清晰条带，说明目的蛋白基本达到电泳纯。

注：M为Protein ladder，1为菌体裂解液，2为穿过液，3为洗涤液，4为低浓度咪唑洗脱液，5为高浓度咪唑洗脱液。

2.4 质谱(MALDI-TOF-TOF)鉴定

通过 MALDI-TOF/TOF串联质谱仪对目的蛋白进行鉴定，有效地优化了诱导条件，通过GPS 3.6(Applied Biosystems)和Mascot2.3(Matrix Science)对数据进行全面分析和蛋白鉴定结果显示(图4)，目的蛋白为美洲锦鳚抗冻蛋白。

图4 重组AFP的质谱鉴定结果

2.5 生物信息学

从图5可知，美洲锦鳚AFP与大西洋狼鱼(Anarhichaslupus)、大西洋鲱(Clupeaharengus)、鳜鱼(Sinipercachuatsi)等鱼类的亲缘关系较近，与其他鱼类的亲缘关系较远。

图5 鱼类AFP氨基酸序列的系统进化树

2.6 鱼类几种抗冻蛋白的性质

从表1和图6看出，在鱼类几种抗冻蛋白中分子量最小的是AFPⅠ，其富含丙氨酸，结构相对简单，由α螺旋组成，主要与冰晶表面的锥面或二级棱面结合。AFP II分为2种亚型，Ca2+依赖亚型与Ca2+不依赖亚型，其中Ca2+有助于蛋白质分子构象的稳定，分子中所含的半胱氨酸形成几对二硫键，整个结构中包括多个α螺旋、β折叠及无规则卷曲，其主要通过锥面或二级棱面与冰晶表面结合。作为球状蛋白的AFP III，主要由多个β折叠组成，与冰晶的锥面和棱面发生相互作用。AFGP富含糖基，由三糖肽(-Ala-Ala-Thr-)串联而成，可分为8种亚型，AFGP1亚型分子量最大，而AFPG8亚型分子量最小，主要与冰晶的棱面相结合。HAFP是最后一类发现的鱼类抗冻蛋白，由相同亚基组成同源二聚体，空间结构呈四螺旋捆，通过锚定机制与冰晶结合[8-11]。

表1 鱼类几种抗冻蛋白的性质

图6 鱼类几种抗冻蛋白的构象

3 讨论

目前，抗冻蛋白的基因工程表达大多是利用原核表达体系。对IPTG诱导条件优化结果表明，不同诱导温度和终浓度诱导剂(IPTG)对表达效率有影响，重组美洲锦鳚抗冻蛋白在18℃及0.1 mmol/L IPTG的诱导条件下表达水平更高。表明，较低的温度降低了蛋白质折叠速率，低浓度的IPTG降低了表达速率，尽可能避免了包涵体的生成，产生的可溶性蛋白更利于分离纯化[12-14]。此外，作为小分子蛋白质的AFP宜采用Tricine-SDS-PAGE进行分析，以弥补普通SDS-PAGE对较低分子量的蛋白质分辨率不高的缺点。当较大的冰晶以小冰晶为单位逐渐生长时，就会形成重结晶，造成组织的物理损伤，这种现象是造成细胞损伤的主要原因。通过与冰晶结合，抑制其生长和变形，并控制及阻断重结晶过程，有效减少细胞和组织的损伤[15-19]。

抗冻蛋白是一种高效的生物活性物质，因具有特殊的热滞活性已被广泛地应用在相关的农业、工业、医学、食品等领域，其在冷冻食品工业中发挥着很好的保鲜作用，BINDSLEV-JENSEN等[20]曾经对抗冻蛋白的致敏性进行研究，发现其与已知的过敏源没有同源性，且在加入抗冻蛋白之后无组胺释放，表明抗冻蛋白无致敏性，是一种比较安全的食品添加剂，应用价值潜力巨大。

4 结论

研究成功构建了美洲锦鳚抗冻蛋白的低温表达系统，通过生物信息学分析，采用邻接法(Neighbor-joining)构建了系统进化树。美洲锦鳚抗冻蛋白诱导的最佳温度为18℃，IPTG加入终浓度为0.1mmol/L。美洲锦鳚AFP与大西洋狼鱼(Anarhichaslupus)、大西洋鲱(Clupeaharengus)、鳜鱼(Sinipercachuatsi)等鱼类的亲缘关系较近，而与其他鱼类的亲缘关系较远。