拮抗茶轮斑病菌生防木霉菌的筛选、鉴定与应用

卢声洁， 赵兴丽， 罗林丽， 张 欣， 程宇豪， 张金峰， 李 帅， 周玉锋*

(1.贵州大学 茶学院， 贵州 贵阳550025； 2.贵州省农业科学院 生物技术研究所， 贵州 贵阳 550006； 3.贵州省农业科学院 茶叶研究所， 贵州 贵阳 550006)

0 引言

【研究意义】茶是一种直饮品，茶叶的安全直接关乎饮茶者的健康。中国是世界上种植茶树面积最广、茶叶产出最多的国家。据统计，2019年我国的茶园总面积达306.52万hm2；干毛茶产量达279.34万t，位居世界第一[1]，且我国的茶园面积和茶叶产量仍呈不断增长趋势。茶轮斑病是茶树重要的叶部病害，开展对茶轮斑病菌具较好拮抗作用生防木霉菌的筛选，对生物防治茶轮斑病及拓宽生防木霉菌的田间应用具有重要意义。【前人研究进展】茶轮斑病是茶树栽培生产中一类主要的叶部病害，病原为拟盘多毛孢属(PestalotiopsisSteyaert)真菌，病菌通常侵染成熟叶片，影响茶树正常生理代谢，导致茶叶减产，甚至引发茶树死亡[2-3]。生产上多采用化学农药防治该病害，但长期施用化学农药不仅使病原菌产生抗药性，达不到防治效果[4-5]；同时，化学农药的过量施用也对茶叶品质、茶园生态及人体健康造成威胁[6-7]。近年来，随着我国化学农药减施增效战略实施，茶园减施化学农药成为必然趋势[8-9]。生物防治具有绿色、安全、无抗药性及无污染等优势，是推进茶园有害生物进行无害化治理的研究热点，生防菌作为化学农药的替代品得到越来越多研究者的青睐。有研究发现，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonasfluorescens)和绿粘帚霉(Gliocladiumvirena)等生防菌对茶轮斑病菌具有较好的防治效果[10]；枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)不仅对茶轮斑病病菌有明显抑制作用，室内盆栽条件下平均防效可达77.6%[11-12]，同时，对氯氰菊酯也表现出较强的降解能力；接种茶轮斑病菌前先接种木霉菌，可有效抑制茶轮斑病菌的侵染[13]。【研究切入点】木霉菌(Trichodermaspp.)具有生长速度快、繁殖能力强、抑菌谱广、能提高植物抗性和促进植物生长等优势，是目前应用较为广泛的生防真菌之一[14]。目前有关应用生防木霉菌防治茶轮斑病菌的研究国内虽已有文献报道，但在贵州鲜见相关文献报道。研究立足本地茶园生境，分离能定殖于茶树根际的木霉菌，不仅能丰富当地木霉菌资源，而且可为生防木霉菌的开发利用拓宽途径。【拟解决的关键问题】筛选对茶轮斑病有明显抑制效果的木霉菌，并通过田间试验探究木霉发酵液对茶叶品质的影响，以期为茶轮斑病的生物防治及木霉菌的田间应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病原菌株 茶轮斑病病原菌菌株ZYP04-5(Neopestalotiopsisellipsospora)为贵州省生物技术研究所重点实验室特色作物病害研究室分离保存。

1.1.2 土样 共计29份土样，于2019年9月至2020年4月采自贵州省都匀市、兴义市、安龙县、独山县和湄潭县健康茶园的茶树根际土壤，

1.1.3 试剂 葡萄糖、琼脂、虎红钠盐及氯霉素，市购；蒸馏水，自制。Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)；引物ITS4和ITS5[15]，EF1-728F/EF1-986R[16]，均由上海生工生物有限公司合成。

1.1.4 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基、PDB液体培养基和虎红酸钠培养基，自制，灭菌后备用[17]。

1.2 方法

1.2.1 茶树根际木霉菌的分离 采用梯度稀释法对采集的茶树根际土样进行木霉菌株分离。称取5 g风干土样倒入装有45 mL无菌水的锥形瓶中，28℃、150 r/min振荡培养30 min，充分混匀后静置30 s，取上清液获得浓度为10-1倍的土样悬液。无菌条件下逐一稀释成10-2倍、10-3倍和10-4倍土样稀释液，静置后用移液枪分别取浓度为10-3倍和10-4倍土样稀释液的样品悬液100 μL滴于虎红酸钠培养基平板上，无菌涂布棒涂匀后封口，28℃培养箱中黑暗、倒置培养，待有菌落形成后将其转接至新鲜PDA培养基上纯化，得到纯化菌株后用硫酸纸袋进行低温保存(-20℃)。

1.2.2 茶轮斑病菌拮抗木霉菌的筛选

1) 平板对峙初筛。采用2点对峙法筛选对茶轮斑病菌具有竞争作用的木霉菌。在距离PDA平板中心2.5 cm处的直径上分别接种直径均为6 mm的培养7 d的木霉菌菌饼和茶轮斑病菌菌饼，3次重复，以单接茶轮斑病菌为对照，25℃避光培养7 d后测量并计算木霉菌对茶轮斑病菌的抑制效果。

2) 抑菌圈复筛。无菌条件下取8个直径6 mm的木霉菌菌饼接种至120 mL的PDB培养基中，28℃、180 r/min条件下振荡培养7 d，静置2 d，经灭菌过滤纸初步过滤后，7 830 r/min常温离心10 min，取上清液通过0.22 μm滤膜。按10%的比例将木霉菌发酵液加至PDA培养基中，混匀倒平板，取茶轮斑病菌饼(直径6 mm)接种于平板中央，3次重复，以加等量无菌水为对照。25℃培养7 d，十字交叉法测量茶轮斑病菌菌落半径，计算其抑菌效果。

3) 木霉发酵液处理对茶叶品质的影响。试验在贵州省茶叶研究所茶园实施。将室内筛选得到的有明显拮抗效果的木霉发酵液采用常规喷雾法喷施于茶树蓬面，以喷施清水为对照，用量8 L，3次重复，小区面积约33 m2，共约150株茶树，随机区组排列。30 d后采集50 cm×50 cm样框中一芽2叶，茶样带回实验室后，先用微波炉中火进行杀青处理90 s；再置于80℃烘箱中进行烘干处理，干样内含物依托贵州省茶叶研究所采用高效液相法检测茶叶品质。

1.2.3 木霉菌株鉴定

1) 形态学观察。挑取培养7 d的木霉菌菌落制成水玻片，于显微镜下观察木霉菌分生孢子梗和分生孢子等的形态特征。

2) 分子鉴定。收集木霉菌菌丝及分生孢子，采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取基因组DNA；采用真菌引物ITS1/ITS4[15]和EF1-728F/EF1-986R[16]分别扩增该菌株的ITS和EF-1α序列。扩增产物送于上海生工生物有限公司进行测序。测序结果经Gene Bank中的BLAST比对分析后下载相似性较高的序列，采用BioEdit进行比对和校正；利用MAGA 6.0将ITS和EF-1α基因序列连接起来，比对拼接后的序列采用RA×ML构建系统进化树，确定该菌与同属菌株间的亲缘关系。

2 结果与分析

2.1 茶轮斑病菌拮抗木霉菌的分离

根据木霉菌的生长特性和菌落形态特征，从29份茶树根际土样中分离纯化出木霉菌35株。以茶轮斑病菌ZYP04-5为靶标菌，采用平板对峙法共筛选出7株对菌株ZYP04-5生长具有明显抑制效果的木霉菌，7 d后各处理病原菌的生长半径为1.317～1.400 cm，与CK间差异显著；抑菌率为71.07%～72.43%，均达70%以上(图1和表1)。对7株木霉菌进行抑菌圈复筛，仅有菌株BLS17112505和菌株DS-GSC-3表现抑制作用，其病原菌的生长半径分别为3.09 cm和1.17 cm，与CK间及二者间差异均显著。其中，菌株DS-GSC-3发酵液的抑菌效果最好，对病原菌ZYP04-5的抑制率达70.53%(表2)。

注：CK为对照，单接种病原菌，其余为木霉菌与病原菌对峙培养；同一平板中左侧为病原菌ZYP04-5，右侧为木霉菌。

表1 木霉菌株对茶轮斑病菌的抑制效果

表2 木霉菌株发酵液对茶轮斑病菌的抑制效果

2.2 木霉发酵液处理茶叶的品质

从表3看出，木霉菌株DS-GSC-3的发酵液处理茶树后，茶叶内含物中氨基酸含量为1.97%，较CK增加13.87%；儿茶素含量为6.96%，较CK增加8.92%。

表3 木霉发酵液处理茶叶的品质

2.3 拮抗木霉菌株的种类鉴定

2.3.1 形态学特征 从图2看出， 在PDA培养基上培养3 d时，菌株DS-GSC-3的菌落长至整个培养皿的2/3左右，菌落呈白色，气生菌丝较少，无分生孢子产生；培养至7 d时，产生大量黄绿色分生孢子，聚集于菌落外圈，形成同心轮纹，无色素和特殊气味产生。在PDA培养基上可产生半球状分生孢子簇，散生，黄绿色或灰绿色，均呈棉絮状。菌丝无色透明，具隔膜，直径为3.35～4.84 μm；分生孢子梗松散对生于节上，在梗顶部瓶梗2～4个呈直角生出，安瓿瓶形；分生孢子黄绿色，亚球形至卵圆形，光滑，直径为2.03～3.31 μm，无厚基孢子。

注：A为菌落正面，B为菌落反面，C为菌丝及分生孢子梗，D为分生孢子。

2.3.2 分子生物学鉴定 对菌株DS-GSC-3基因组DNA的ITS和EF-1α片段进行PCR扩增，测序后得到序列长度分别为498 bp和575 bp的片段。将序列提交NCBI比对分析后，选取并下载与菌株DS-GSC-3序列相似性高的菌株为内群，以Nectriaberolinensis和Nectriaeustromatica为外群构建系统发育树 (图3)，菌株DS-GSC-3以99%的支持率与Trichodermabrevicompactum聚为一枝。结合该菌株形态学特征确定，菌株DS-GSC-3为短密木霉(Trichodermabrevicompactum)。

图3 基于 ITS和 EF-1α构建的系统发育树

3 讨论

自1932年WEINDLING[18]首次发现木霉菌对立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)菌丝有重寄生作用后，有许多关于利用木霉菌防治植物病原真菌、细菌及病原线虫等的研究报道[14]。如木霉菌株SMF2可有效抑制姜瘟青枯假单胞菌[19]；木霉菌Tr16和Tr50对桑椹菌核病病原菌核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)有明显拮抗作用，发酵液的10倍稀释液田间防效可达91.27%和82.53%，优于80%多菌灵500倍稀释液的防治效果[20]；哈茨木霉菌TRI2对田间黄瓜根结线虫的防治效果可达72.2%，与阿维菌素的防治效果相近[21]；绿色木霉制剂36 kg/hm2处理大白菜可有效降低软腐病和其他病害的发病率，增产达63.33%[22]；茶树修剪后喷施木霉菌制剂，可有效抑制茶枝梢黑点病和茶根腐病发生[23]。可见，利用木霉菌防治茶轮斑病菌具有一定的可行性。据报道，现有超过250余种木霉商业化杀菌剂在全球范围内登记上市[24]，木霉在植物病害生物防治方面已展现出巨大的应用潜力。茶轮斑病发生危害对茶树长势、茶叶品质和产量影响较大，因此，分离筛选高效的生防木霉菌，合理利用生物防治手段控制茶轮斑病为害具有十分重要的现实意义。

4 结论

研究立足茶园生境，分离能定殖于茶树根际的木霉菌，平板对峙和抑菌圈相结合筛选获得对茶轮斑病菌具有拮抗作用的木霉菌株DS-GSC-3，该菌株对茶轮斑病菌的生长抑制率为72.12%，发酵液对茶轮斑病菌的抑菌率为70.53%；发酵液喷施茶蓬30 d后，较对照分别提高茶叶中氨基酸和儿茶素含量13.87%和8.92%。结合形态学特征和分子发育分析，确定菌株DS-GSC-3为短密木霉(Trichodermabrevicompactum)。短密木霉菌株DS-GSC-3的发现为丰富木霉菌的开发利用拓宽了途径，并为木霉菌防治茶轮斑病奠定了一定的理论基础。关于短密木霉DS-GSC-3对茶轮斑病病原菌的拮抗机理、抗菌活性物质以及适于田间防控应用的剂型研发应用还需深入开展研究。