草莓根腐病病原菌鉴定及其防治药剂筛选

熊明国， 高欣梅

(商丘职业技术学院， 河南 商丘 476006)

0 引言

【研究意义】草莓具有较高的经济价值，在我国的水果产业中占有重要地位。近年来，草莓种植业得到快速发展，种植面积不断增加，主要以塑料大棚、日光温室种植方式为主，高湿、连作重茬等导致草莓根部病害加重，对草莓的品质和产量产生严重影响。【前人研究进展】草莓根腐病是常见的土传病害，病原菌种类超过20种[1]。目前已发现导致草莓根腐病发生的病原菌多达20余种[2-3]，且不同地区和品种间的致病菌种类差异较大。有研究指出，河南省商丘市草莓丰香根腐病病原菌主要是链格孢菌[4]；北京地区草莓根腐病的病原菌为双核丝核菌[5-6]，而河北承德地区的病原菌为立枯丝核菌[5]；安徽省长丰县草莓根腐病病原均为尖孢镰刀菌[7]；山东省青岛市草莓根腐病的病原菌有棒形拟盘多毛孢菌、胶孢炭疽菌[8]。目前，治疗草莓根腐病多采用化学药剂进行防治。由于市面上常见的药剂类型多样，病原菌具有多样性、根腐病发病具有滞后性，加之频繁使用化学农药等原因，导致抗药性加快，防治效果不理想[9]。【研究切入点】河南省南阳市素有“草莓之乡”之称，但是近年来草莓根腐病频繁发生，病情严重时甚至导致绝收[4]。目前，针对河南省南阳市草莓根腐病的病原菌鉴定和防治研究尚未见报道。【拟解决的关键问题】于2018年10月在河南省南阳市唐河县代庄村种植园采集具有草莓根腐病典型症状的发病植株，通过病原菌分离纯化、致病性检测结合形态学与分子生物学鉴定等对其致病病原菌种类进行鉴定，同时采用室内毒力测定与田间防治相结合，对比和分析甲基硫菌灵、杀毒矾、寡雄腐霉、哈茨木霉、多抗霉素和枯草芽孢杆菌等6种药剂的防治效果，以期为有效控制当地及类似地区的草莓根腐病提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 感病植株样品 2018年10月于河南省南阳市唐河县代庄村连作3年的草莓种植园采集具有典型症状的发病植株，品种为丰香和隋珠，各品种长势均匀，处于收获初期。

1.1.2 试剂 马铃薯琼脂培养基(PDA)培养基，自制；察氏(Czapek)培养基，北京索莱宝科技有限公司；Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒，上海生工生物工程有限公司；ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)通用引物，北京天根公司。

1.1.3 药剂 70%甲基硫菌灵(施用剂量1 200 g/hm2)，河北青园有限公司；杀毒矾(有效成分56%代森锰锌+8%恶唑烷酮，施用剂量3 000 g/hm2)，安阳市五星农药厂；15%多抗霉素(施用剂量15 000 g/hm2)，山东省德州祥龙生化有限公司；3亿孢子/g哈茨木霉(施用剂量1 500 g/hm2)，济宁玉园生物科学有限公司；0.1亿孢子/g寡雄腐霉(施用剂量300 g/hm2)，北京比奥瑞生物科技有限公司；1 000亿芽孢/g枯草芽孢杆菌(施用剂量1 500 g/hm2)，河北闰沃生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离纯化 采用组织分离法[10]对病原菌进行分离。用清水洗净患病草莓植株根部，于病健交界位置剪取长约0.5 cm的组织，先放入70%乙醇中消毒10 s，再放入0.1% HgCl2中浸泡30 s，无菌水冲洗并用无菌滤纸吸干水分后，将其接种至PDA培养基上，25℃培养箱中培养2～3 d。待菌落长出后，用接种环挑取少量菌落进行纯化，获得菌株保存备用。

1.2.2 病原菌的致病性检测 纯化后菌株的形态特征与培养性状完全一致，随机挑选3个菌株M1、M2和M3，采用伤根接种法测定其致病性[11-14]。菌株接种至PDA培养基上于28℃培养7 d，用打孔器打取直径5 mm的菌饼备用，同时制备浓度1.5×107个/mL的孢子悬浮液备用。于草莓根部造成微伤口，每株灌入孢子悬浮液25 mL，3次重复，每重复为3株，以灌入无菌水的处理作对照。将接种植株在22℃培养箱中保湿培养，接种2周后调查发病情况。将菌饼接种至草莓幼苗上，并置于20℃、70%相对湿度温室中培养，14 d后观察草莓植株发病情况，3次重复，每重复处理3株，以未接种的植株作对照。

1.2.3 病原菌鉴定

1) 形态学鉴定。将分离的菌株接种至PDA培养基上，25℃黑暗培养7 d后观察并记录菌落的形态特征。待病原菌产孢后制作玻片，观察其产孢细胞和分生孢子的形态结构，根据形态特征进行病原菌的初步鉴定。

2) 分子生物学鉴定。将分离的菌株接入Czapek培养基，28℃振荡培养7 d，离心后将沉淀收集，采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取病原菌基因组DNA。利用引物ITS1和ITS4对病原菌基因组DNA进行PCR扩增。PCR反应总体积为25 μL：10×PCR 缓冲液2.5 μL，dNTPs 1 μL，上下游引物均0.5 μL，DNA模板0.5 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，加ddH2O至25 μL。反应程序：95℃预变性4 min；95℃变性40 s，57℃退火40 s，72℃延伸60 s，35个循环；72℃延伸6 min，最后于5℃终止反应。将PCR扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测拍照，送至上海生工生物工程有限公司测序。用DNAStar对所测得的原始序列进行数据处理，并将测序结果在GenBank上进行同源性比较，然后利用MEGA 5.1将获得病菌的ITS序列与NCBI网站上已发表的相似菌株的ITS序列进行系统发育树分析。

1.2.4 药剂室内毒力测定 采用生长速率法[15]测定甲基硫菌灵、杀毒矾、寡雄腐霉、哈茨木霉、多抗霉素和枯草芽孢杆菌等6种药剂对分离的草莓根腐病菌的毒力。用PDA培养基配制药剂培养基平板，无菌水培养基作对照，3次重复，用打孔器在菌落边缘切下直径为70 mm的菌饼接种至培养基平板中央，于25℃培养5 d(对照基本长满培菌养皿)，采用十字交叉法测出各菌落直径，并计算抑菌率。

1.2.5 田间防治效果 试验在河南省南阳市唐河县代庄村种植园进行，丰香(1号棚)和隋珠(2号棚)2个品种各1个棚，试验各设7个处理，每个药剂1个处理，剂量采用生产厂家推荐剂量，以清水喷施为对照(CK)，3次重复，不设置浓度梯度，比较甲基硫菌灵、杀毒矾、寡雄腐霉、哈茨木霉、多抗霉素和枯草芽孢杆菌等6种药剂对草莓根腐病的防治效果。1号棚、2号棚各小区面积均为17 m2(6.8 m×2.5 m)。每次重复处理50株草莓，随机区组排列。2个棚区的草莓植株长势一致，各小区均实施相同的肥水管理，草莓根腐病为自然发病。各药剂于草莓定植后7 d进行第1次灌根处理，60 d后再施药1次。于第2次施药后30 d调查记录植株的发病情况。各小区均采用对角线五点取样法，每点取3株，统计并计算发病率和防效。

2 结果与分析

2.1 病原菌的形态学鉴定

发病植株地上部分长势衰弱，叶片下垂，不同程度变黑腐烂，果实无法自然膨大，整株萎蔫(图1)；地下部分须根较少且较细，表皮呈现褐色病斑，须根后期变黑并腐烂，表皮与木质部发生分离。从病株上分离到22个菌株，且特征较为一致。由图1可见，在PDA培养基上生长4 d后，菌落呈白色，菌丝绒状且大多数呈分支状、含有大型分生孢子和小型分生孢子。大型分生孢子较为匀称，呈镰刀状，具有1～4个隔膜，但大多数具有3～4个隔膜，大小为(23.5～42.8)μm×(2.8～5.6)μm。小型分生孢子呈肾形或卵形，具有0～1个隔膜，大小为(6.6～22.7)μm×(2.3～3.7)μm，产孢细胞上着生假头状。综合以上形态学特征，初步认为草莓根腐病病原菌为尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)。

注：a为草莓根腐病发病株田间症状，b为病原菌菌落，c为病原菌分生孢子。

2.2 病原菌的致病性

从图2看出，接种21 d后植株的发病症状明显，叶片的尖部出现脱水并逐渐变为灰绿色，最终整株死亡。将发病植株取出发现，根系已腐烂变黑。症状与草莓根腐病田间自然发病症状一致。对照组生长正常，未出现发病症状。再次对发病植株的病变组织进行病原菌分离，结果目标分离物的获得率为100%，表明再分离获得的菌株与原接种病菌一致，为河南省南阳市唐河县代庄村种植园草莓根腐病的病原菌。

图2 回接试验草莓植株的发病症状

2.3 病原菌的分子生物学鉴定

从图3看出，将菌株M1、M2和M3的基因组DNA用rDNA-ITS进行PCR扩增、测序，均得到大小约360 bp的特异性片段，且序列相同，在GenBank中的登录号分别为MN507109、MN507110和MN507111。利用NCBI数据库，将片段序列进行Blast比对，菌株M1、M2和M3的序列与菌株FusariumoxysporumCBS420.90(登录号：EF056790)和NRRL22518(登录号：FJ985265)的序列同源性最高，为99%以上。由图4可知，菌株M1、M2、M3与菌株FusariumoxysporumCBS420.90(登录号：EF056790)和NRRL22518(登录号：FJ985265)为同一分支，支持率高达100%。由此进一步确定分离菌株为尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)。

注：M为DNA Marker，1～2泳道为菌株M1，3～4泳道为菌株M2，5～6泳道为菌株M3。

图4 分离菌株rDNA-ITS序列的系统发育树

2.4 6种药剂对病原菌的室内毒力测定

从图5看出，6种药剂对尖孢镰刀菌均有不同程度的毒力作用，其毒力强度为甲基硫菌灵>哈茨木霉>枯草芽孢杆菌>多抗霉素>杀毒矾>寡雄腐霉。其中，甲基硫菌灵和哈茨木霉的毒力较强，其EC50分别为4.98 mg/mL和38.39 mg/mL；其次为枯草芽孢杆菌和多抗霉素，其EC50分别为57.25 mg/mL和67.98 mg/mL；杀毒矾对尖孢镰刀菌的毒力相对较弱，其EC50为192.76 mg/mL；寡雄腐霉对尖孢镰刀菌的毒力较弱，其EC50为610.55 mg/mL。

图5 6种药剂对病原菌的毒力强度

2.5 6种药剂对丰香和隋珠根腐病的防治效果

从表1看出，不同药剂对同一品种草莓及同种药剂对不同品种草莓的防治效果均存在差异。其中，杀毒矾对丰香和隋珠均具有良好防治效果，防效均高达80.16%；甲基硫菌灵和枯草芽孢杆菌对丰香的防治效果也较好，防效也达80.16%，二者对隋珠的防治效果均为69.95%；哈茨木霉对丰香和隋珠的防治效果均为69.95%；多抗霉素对丰香和隋珠的防治效果分别为69.95%和50.18%；寡雄腐霉对丰香和隋珠的防治效果均较差，分别为50.18%和40.08%。对丰香而言，杀毒矾、甲基硫菌灵和枯草芽孢杆菌的防治效果较好；对隋珠而言，杀毒矾的防治效果较好，其次是甲基硫菌灵、哈茨木霉和枯草芽孢杆菌。

表1 6种药剂对丰香草莓和隋珠草莓根腐病的防治效果

3 讨论

尖孢镰刀菌可导致草莓植株根部和叶片病害，此外，还可以引起苜蓿[16]、三七[17]、香蕉[18]及西瓜[19]等植株发病。为了防止发生病原菌抗药性和环境污染，有益微生物防治病害已逐渐成为一种理想的途径。室内毒力测定结果表明，6种药剂中甲基硫菌灵对尖孢镰刀菌的毒力最强，其次为哈茨木霉，枯草芽孢杆菌对尖孢镰刀菌的毒力也较强；同时，各药剂的田间防治结果表明，6种药剂对丰香和隋珠2个草莓品种根腐病的防治效果差异较大，其中杀毒矾对丰香和隋珠的防效最佳，甲基硫菌灵、枯草芽孢杆菌对丰香和隋珠的防治效果也较为明显。由于杀毒矾、甲基硫菌灵为化学药剂，长期使用易造成环境污染和产品的农药残留，而枯草芽孢杆菌为生物药剂，且其活性成分主要为生防类芽孢杆菌，可以在土壤、植株体内定殖，可产生抗菌物质、促进植物生长，具有较好的生防能力[20]，可减少农药使用量，降低草莓产品的农药残留，因此，建议在当地大面积试验示范推广应用。该研究使用的生防药剂均为单一菌剂，具有适应性不强、需菌量较大等缺陷，今后需要在多菌剂复合应用方向进行深入研究。

4 结论

通过对河南省南阳市唐河县代庄村草莓种植园草莓根腐病样品进行病原菌分离纯化，共分离获得22个菌株，纯化后菌株的形态特征与培养性状完全一致，形态学特征和测量值与尖孢镰刀菌相符；随机挑选3个菌株M1、M2、M3并进行rDNA-ITS序列测定，结果3个菌株的序列与GenBank中尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)对应的序列同源性最高，为99%以上；同时，3个菌株的序列在系统发育树上与尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)为同一分支，支持率高达100%。由此确定河南省南阳市唐河县代庄村草莓种植园草莓根腐病由尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)侵染所致。室内毒力测定结果表明，甲基硫菌灵对尖孢镰刀菌的毒力最强，EC50为4.98 mg/mL；哈茨木霉其次，EC50为38.39 mg/mL；枯草芽孢杆菌对尖孢镰刀菌的毒力也较强，EC50为57.25 mg/mL。田间防治结果表明，甲基硫菌灵、杀毒矾、寡雄腐霉、哈茨木霉、多抗霉素和枯草芽孢杆菌等6种药剂对丰香和隋珠2个草莓品种根腐病的防治效果差异较大，其中，杀毒矾对丰香和隋珠的防效最佳，均为80.16%；甲基硫菌灵和枯草芽孢杆菌的防治效果也较为明显，均分别为80.16%和69.95%。枯草芽孢杆菌的防治效果较好，且其活性成分主要为生防类芽孢杆菌，可减少农药使用量，降低草莓产品的农药残留，可在当地大面积示范推广应用。