中性氧化铝柱层析分离纯化鲨肝醇制品及其组成分析

宋恭帅，戴志远，2*，沈 清，2，崔益玮，朱蓓薇，王加斌，郑平安

（1 浙江工商大学海洋食品研究院 杭州310012 2 浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室 杭州310012 3 大连工业大学食品学院 辽宁大连116034 4 海力生集团有限公司 浙江舟山316021）

鲨鱼肝油是烷基甘油、角鲨烯等生物活性物质的重要来源，具有良好的生理保健功能[1]。烷基甘油是一种醚脂质化合物，根据甘油骨架上连接的烷烃链饱和度与长度的不同，主要分为鲨肝醇（十八烷氧基甘油）、鲨油醇（十八一烯烷氧基甘油）、鲛肝醇（十六烷氧基甘油）等[2]。其中，鲨肝醇是烷基甘油重要的组成部分，具有对抗因细胞毒类药物或苯中毒引起的造血系统抑制，抗癌、防癌，促进白细胞增生及抗放射线等作用，是重要的免疫刺激因子[3-4]。目前鲨肝醇富集工艺较为不成熟且不同原料中的鲨肝醇含量参差不齐，在售的鲨肝醇产品为富含鲨肝醇的鲨鱼肝油，大多为化学合成，而化学合成的鲨肝醇存在生物活性功效低下等问题[2]。

目前，国内外鲨肝醇分离、纯化的方法主要有超临界流体法、分子蒸馏法、酯交换法、柱色谱法、薄层色谱法（TLC）等[5-6]。V ázquez 等[7]采用超临界流体萃取技术分离、纯化鲨鱼肝油中的鲨肝醇，得到高纯度的鲨肝醇。然而，超临界流体萃取法设备投入高，操作相对复杂。郭正霞[2]利用氧化铝柱层析技术分离、纯化鲨肝醇，使鲨鱼肝油不皂化物中鲨肝醇含量明显提高，其未考察洗脱液、洗脱流速等因素对柱层析效果的影响。本研究以鲨鱼肝油中不皂化物为原料，采用中性氧化铝柱层析分离、纯化鲨肝醇的工艺，通过气相色谱法（GC）与薄层层析法（TLC）分析制备样品中角鲨烯等活性物质，以期为鲨肝醇富集工艺及鲨鱼肝油的高值化利用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

粗制鲨鱼肝油，海力生集团有限公司；鲨肝醇标品（纯度≥98%）、硅烷化试剂（VBSTFA∶VTMCS=99∶1）、100～200 目中性氧化铝，国药集团化学试剂有限公司；角鲨烯标品（纯度≥99%），美国Sigma公司；氢氧化钾、乙醇（95%）、盐酸、二氯甲烷、正己烷、无水甲醇、乙醚、乙酸等均为分析纯级，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

7890B 气相色谱仪，美国Agilent 公司；电子天平AL204 型，梅特勒-托利多有限公司；层析柱（Φ3.0 cm×60 cm）、硅胶板（Φ 5.0 cm×10.0 cm），国药集团化学试剂有限公司；旋转蒸发仪RE-3000，上海亚荣生化仪器厂；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸易有限工艺；BT50S 蠕动泵，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；Fresco-21G 台式离心机，美国Thermo Fisher 公司；Millipore 超纯水系统，美国Millipore 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 不皂化物的提取 参考GB/T 5535.2-2008《动植物油脂 不皂化物测定 第2 部分：己烷提取法》[8]和叶虔臻等[9]的方法提取鲨鱼肝油中不皂化物。称取50 g 鲨鱼肝油于500 mL 三颈烧瓶中，加入150 mL 1 mol/L 氢氧化钾-乙醇溶液，在70℃条件下反应50 min。待反应结束后，从冷凝管顶部加入150 mL 蒸馏水，冷却至室温，再将反应液倒入500 mL 分液漏斗中，用200 mL 正己烷萃取3次，合并萃取液，然后用10%乙醇水溶液清洗萃取液至中性。若在清洗过程中出现乳浊现象，则加少量无水乙醇破乳。萃取液经无水硫酸钠脱水、旋蒸得不皂化物，充氮后低温保存备用。

1.3.2 层析柱的制作 参考龚金炎等[10]的方法制作中性氧化铝层析柱。称取250 g 粒径100～200目的中性氧化铝与500 mL 蒸馏水混合，加入浓盐酸，调节溶液pH 值至2，保持10 min 后用蒸馏水洗涤至中性。置105℃条件下活化24 h。采用干法装柱，待氧化铝界面不再下降，用二氯甲烷洗脱除柱子中的杂质，平衡2 h，静置待用。

1.3.3 TLC 检测 参考郭正霞[2]的方法对样品进行TLC 检测，并作适当修改。具体操作如下：取硅胶板置于103℃条件下干燥活化1 h，放入干燥器中冷却至室温待用。称取样品100 mg 溶解于1 mL 二氯甲烷中，毛细管点样于TLC 硅胶板上，以V正己烷∶V乙醚∶V乙酸=85∶15∶1 为展开液，碘蒸气显色。

1.3.4 GC 测定鲨肝醇将TLC 硅胶板上对应的鲨肝醇条带刮下，加入500 μL 硅烷化试剂（VBSTFA∶VTMCS=99∶1），于65℃水浴30 min，冷却后氮气吹扫，脱除多余溶剂后加入2 mL 正己烷复溶，过滤待测。加入硅烷化试剂的目的是进行衍生化处理。

气相色谱条件：HP-5 毛细管色谱柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；升温程序：初温200℃保持5 min 后，以5℃/min 升至280℃，保持20 min；进样口温度250℃，不分流进样，进样量1 μL，载气流速1 mL/min。因鲨肝醇标准品需衍生化处理后方可GC 检测，故无法绘制标准曲线。本试验采用峰面积归一化法分析鲨肝醇的纯度。每组样品重复测试3 次。

1.3.5 GC 测定角鲨烯气相色谱条件：HP-5 毛细管色谱柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；升温程序：初温160℃，以15℃/min 升至220℃，保持2 min；然后以5℃/min 升至280℃，保持20 min；最后以5℃/min 升至300℃，保持2 min。进样口温度250℃，分流比1∶10，进样量1 μL，载气流速1 mL/min。每组样品重复测试3 次。

准确称取25 mg 角鲨烯标准品于25 mL 容量瓶中，加入少量正己烷定容至刻度，配制1 mg/mL角鲨烯标准储备液。分别取一定量的标准储备液用正己烷稀释，配成质量浓度分别为20，50，100，200，400 μg/mL 及800 μg/mL 的标准工作液。以各质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制角鲨烯标准曲线。

1.3.6 响应面试验设计 在单因素试验的基础上，依据DesignExpert 8.0 软件中的Box-Behnken设计中心组合试验，选取洗脱液比例、上样量和洗脱流速3 个因素，每40 mL 为1 个收集单位，以鲨肝醇纯度为响应值，做三因素三水平的中心组合试验，以确定氧化铝柱层析分离富集鲨肝醇最佳工艺参数。响应面因素水平及编码值见表1。

表1 响应面因素与水平表Table 1 The levels and factors of response surface methodology（RSM）

1.3.7 数据处理每个样品平行测定3 次，平均值、标准差和显著性水平均采用SPSS 21.0 软件计算，显著性分析的置信区间为95%，用Microsoft Word、Origin 7.5 及Excel 绘制图表。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果

2.1.1 洗脱液比例对洗脱过程的影响 上样量3 g，洗脱流速2 mL/min，研究洗脱液比例（V二氯甲烷∶V无水甲醇）对中性氧化铝柱分析分离纯化鲨肝醇的作用效果。

由图1可知，鲨肝醇纯度随着洗脱剂比例的减少呈先上升后下降的趋势。在选择洗脱液时，一般先选择极性较小的溶剂，根据分离效果再依次增大极性。本试验中甲醇的极性要大于二氯甲烷[11]。当仅选择二氯甲烷为洗脱剂时，其分离效果要弱于二氯甲烷与甲醇（体积比9∶1）复配使用，其原因可能是二氯甲烷的极性弱，无法很好地分离鲨肝醇。而随着甲醇比例的增加，鲨肝醇的纯度不断下降，这是由于复配洗脱剂的极性过强而将部分杂质混入鲨肝醇中。最终选定洗脱剂比例（V二氯甲烷∶V无水甲醇）为9∶1 进行优化，此时第7 管鲨肝醇纯度最高。

图1 不同洗脱液比例对鲨肝醇纯度的影响Fig.1 Effects of different eluent ratio on purity of batyl alcohol

2.1.2 上样量对洗脱过程的影响 洗脱液比例（V二氯甲烷∶V无水甲醇）为9∶1，洗脱流速为2 mL/min，研究上样量对中性氧化铝柱分离、纯化鲨肝醇的作用效果。

由图2可知，上样量在1～3 g 范围，鲨肝醇纯度随上样量的增加而增加，然而上样量继续增加，鲨肝醇纯度呈下降的趋势。这一结论与龚金炎等[10]的研究结果基本一致。分析其原因可能是：当上样量过低时，氧化铝层析柱无法被充分利用而造成浪费，同时洗脱剂消耗量大，使不皂化物中的鲨肝醇与杂质无法有效分离；而当上样量过大时，极易造成氧化铝层析柱负载过大，吸附效率降低。采用上样量3 g 进行后续优化。此外，在色谱柱负载量0.012 g/g 氧化铝、上样量3 g 时，第7 管鲨肝醇纯度最高。

图2 不同上样量对鲨肝醇纯度的影响Fig.2 Effects of different loadings on purity of batyl alcohol

2.1.3 洗脱流速对洗脱过程的影响 洗脱液比例（V二氯甲烷：V无水甲醇）为9∶1，上样量为3 g，研究洗脱流速对中性氧化铝柱分离、纯化鲨肝醇的作用效果。

由图3可知，鲨肝醇纯度随洗脱流速的升高呈先增加后减小的趋势。分析原因可能是：在较低洗脱流速下，鲨肝醇在氧化铝层析柱中停留时间变长，而中性氧化铝具有很强的吸附作用，从而导致部分鲨肝醇被吸附在层析柱中而无法被洗脱；当洗脱流速过高时，不皂化物快速流过层析柱而使鲨肝醇与杂质无法有效分离。宋恭帅等[12]认为柱层析洗脱流速在1～2 mL/min 之间为宜，本研究结果与之一致。最终选定2 mL/min 为最佳洗脱流速。此外，在洗脱流速为2 mL/min 时，第7 管鲨肝醇纯度最高。

图3 不同洗脱流速对鲨肝醇纯度的影响Fig.3 Effects of different washout velocity on purity of batyl alcohol

2.2 响应面试验

2.2.1 模型拟合 响应面试验设计及结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 The Box-Behnken design and results

对表2中数据进行多元二项式回归拟合，得到洗脱液比例A、上样量B、洗脱流速C 与鲨肝醇纯度之间的二次多项回归方程为：

鲨肝醇纯度=18.08+0.84A+0.47B-0.84C+0.71AB+0.87AC+1.04BC-2.01A2-1.66B2-2.02C2。

由表3可知，二项式回归方程的F 值为35.57，其P 值＜0.0001，差异极显著；对方程进行失拟项检验，F 值为2.46，其P 值为0.2020＞0.05，不显著；从拟合方程的相关系数可见，多元二次方程拟合相关系数高于0.90，因此拟合的回归模型可靠，可用来预测响应值与反应参数之间的关系。此外，A、B、C、A2、B2和C2的P 值均小于0.05，说明它们对试验结果影响显著，且洗脱液比例A 是影响鲨肝醇纯度的最主要因素。

表3 二项式回归模型的方差分析Table 3 Analysis of variance in binomial regression model

（续表3）

2.2.2 响应面分析及反应参数优化 根据回归方程绘制响应值鲨肝醇纯度与3 个因素的等高线及响应面图，见图4～6。

图4 洗脱液比例与上样量交互作用响应面图与等高线图Fig.4 Response surface and its contour plots for the interactive of eluent ratio and loading on batyl alcohol content

图5 洗脱液比例与洗脱流速交互作用响应面图与等高线图Fig.5 Response surface and its contour plots for the interactive of eluent ratio and washout velocity on batyl alcohol content

图6 上样量与洗脱流速交互作用响应面图与等高线图Fig.6 Response surface and its contour plots for the interactive of loading and washout velocity on batyl alcohol content

通过对上述试验结果的分析，确定回归模型预测的最佳反应参数为：V二氯甲烷∶V无水甲醇=9.17∶0.83，上样量3.11 g，洗脱流速1.93 mL/min，预测结果为18.08%。

2.2.3 验证检验 为验证模型的准确性，在以上最优条件下做3 次平行试验，结果见表4。试验组平均值与预测值相对误差小于1%，说明通过响应面优化得到的参数条件准确可靠。

表4 响应面模型的验证Table 4 Validation of response surface models

2.3 鲨肝醇制品组成分析

2.3.1 TLC 结果 分别对鲨肝醇与角鲨烯标准品、鲨鱼肝油富集前、后样品进行点板显色分析，结果如7所示。中性氧化铝层析柱分离、纯化鲨肝醇效果明显，能将鲨鱼肝油中鲨肝醇与角鲨烯分离。

图7 薄层层析分析结果Fig.7 The results of thin layer analysis

2.3.2 组成成分分析 目前，市售的天然鲨肝醇产品主要指富含鲨肝醇的鲨鱼肝油，一般纯度在20%左右[6]。本研究对影响中性氧化铝层析柱分离、纯化鲨肝醇作用效果的主要因素，即洗脱液比例、上样量及洗脱流速进行优化，得到最优参数条件，使鲨肝醇纯度达18.23%，此结果与市售鲨肝醇产品纯度相差不大。图8为鲨肝醇富集前、后的气相色谱图。鲨鱼肝油不皂化物气相检测结果如图8a所示，不皂化物中主要含有鲨肝醇与角鲨烯2 种活性物质，根据面积归一法计算可得鲨肝醇含量为9.42%，角鲨烯含量为69.14%。在洗脱液比例（V二氯甲烷∶V无水甲醇）为9∶1，上样量3 g 及洗脱流速为2 mL/min 条件下，鲨肝醇经中性氧化铝层析柱分离纯化后的气相色谱分析结果如图8所示，鲨肝醇含量有显著提升。仅从谱图看，鲨肝醇与角鲨烯含量的差距在缩短，鲨肝醇占18.23%，而角鲨烯占60.32%。试验结果说明中性氧化铝柱层析技术能有效分离纯化鲨鱼肝油中的鲨肝醇。

图8 鲨肝醇分离纯化前、后气相色谱图Fig.8 Gas chromatogram of batyl alcohol before and after separation and purification

角鲨烯是由6 个异戊二烯连接而成的高度不饱和的直链三萜类化合物，常温下为淡黄色或无色油状液体，具有提高缺氧耐受力功能，抑制微生物生长，抗菌消炎，调节胆固醇代谢等生物活性功效，被广泛应用于食品、医药及化妆品等行业中[14-16]。角鲨烯来源广泛，存在于微生物、植物种籽、微藻、鲨鱼肝脏及人体皮脂中[17-18]。然而，因植物及其加工副产物中角鲨烯含量过低而无法满足实际工业生产所需，鲨鱼肝油仍是生产高纯度角鲨烯的主要原料[19]。鲨鱼肝油主要含有角鲨烯、烷基甘油及少量EPA、DHA、维生素A 及维生素E等多种人体所需的营养素，是高品质鱼肝油之一[20]。为了定量分析富集前、后鲨鱼肝油中角鲨烯含量的变化，绘制角鲨烯标准曲线。本研究中角鲨烯标准品气相分析结果如图9a所示，由于在测定角鲨烯标准品时未衍生化处理，故角鲨烯的出峰时间约在15.017 min，比图8中的出峰时间提前了2.7 min 左右。角鲨烯标准曲线如图9b所示，横坐标为角鲨烯质量浓度（μg/mL），纵坐标为峰面积，线性回归方程为：y=1.9214x+6.089，R2=0.9999。根据标准曲线计算可得，富集前角鲨烯纯度为54.21%，而富集后角鲨烯纯度为49.18%。分析其原因可能是：中性氧化铝层析柱对角鲨烯的吸附效果较强，而洗脱液未及时有效地将角鲨烯洗脱。一般地，常用硅胶柱分离、纯化角鲨烯，选择正己烷与乙酸乙酯复配作为洗脱液[11]。

图9 角鲨烯标准品气相色谱图Fig.9 Gas chromatogram of squalane standard

综上所述，中性氧化铝柱层析能有效分离纯化鲨肝醇，并对鲨鱼肝油不皂化物中的角鲨烯有筛选作用。在今后的研究中可用已脱除角鲨烯的不皂化物为原料进行鲨肝醇制品的富集纯化。

2.3.3 方法学验证为了验证GC 仪器的稳定性，在鲨鱼肝油不皂化物中添加角鲨烯标准液进行精密度及回收率的试验。本研究选取10，100，400 μg/mL 与800 μg/mL 进行试验。在相同条件下连续平行测试3 d，每个质量浓度平行测定5 次，计算日间精密度和日内精密度。由表5可知，在日间精密度与日内精密度检测中回收率在98.71%～101.98%，RSD 在2.76～8.65，结果表明该仪器有较高的稳定性与精密度。

表5 鲨鱼肝油不皂化物中角鲨烯的精密度与加标回收率Table 5 Precision and spike recovery of squalene in shark liver oil unsaponifiables

3 结论

采用粒径100～200 目的中性氧化铝为填料，研究其柱层析制备鲨肝醇制品的方法。采用TLC对样品进行定性分析，GC 对样品进行定量分析并验证仪器稳定性与精密度。采用响应面法优化中性氧化铝柱层析分离、纯化鲨肝醇工艺参数，得到最佳反应参数为：洗脱液比例（V二氯甲烷∶V无水甲醇）9∶1，上样量3 g，洗脱流速2 mL/min，所得鲨肝醇制品纯度达18.23%。对鲨肝醇富集前、后的组成成分分析可知，中性氧化铝柱层析分离、纯化鲨肝醇的同时，会对不皂化物中角鲨烯的含量造成损失。角鲨烯纯度由54.21%减至49.18%。

本文尚未有效分离鲨鱼肝油不皂化物中的鲨肝醇与角鲨烯，今后将继续开展鲨肝醇分离纯化技术及功能活性等研究。