基于网络药理学探讨知母皂苷A-Ⅲ抗鼻咽癌的作用机制

成南南 徐 宁 杨萌哲 白先愚 郭兴喆 杨建宇 吕安乔 黄元姣，▲

1.广西医科大学生物分子医学研究实验室，广西南宁 530021；2.广西医科大学生命科学研究院，广西南宁 530021

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我国高发的头颈部恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均高于全球平均水平[1]，研究发现中药治疗NPC可起到缓解症状、减毒增效和提高患者生存质量的作用[2]。中药知母具有抗菌、抗肿瘤、解热和抗炎等多种药理活性[3]，知母皂苷A-Ⅲ是其药理活性最主要的成分。近年来，研究发现知母皂苷A-Ⅲ对多种肿瘤细胞均有良好的抑制作用[4-5]，推测其为良好的抗癌中药，但目前对NPC尚未有研究。因此，本研究借助网络药理学，深入挖掘知母皂苷A-Ⅲ抗NPC的潜在靶点和作用机制，以期为知母皂苷A-Ⅲ的进一步研究提供方向，为临床用药提供循证依据。

1 资料与方法

1.1 知母皂苷A-Ⅲ的靶点预测

通过Swiss Target Prediction数据库获取知母皂苷A-Ⅲ靶点蛋白，并消除重复和不规范的命名，标准化命名。

1.2 NPC相关疾病靶点的获取和交集靶点的确定

利用GeneCards数据库检索NPC疾病相关基因，通过Venny平台将知母皂苷A-Ⅲ的预测靶点与NPC的相关疾病靶点相互映射取交集，获得知母皂苷A-Ⅲ抗NPC作用靶点。

1.3 知母皂苷A-Ⅲ与NPC相关靶点的蛋白互作网络构建

将Venny图获取的交集靶点输入STRING数据库进行可视化分析，最终获得知母皂苷A-Ⅲ与NPC相关靶点蛋白质相互作用网络图。

1.4 GO（基因本体）和KEGG（京都基因与基因组百科全书）相关靶点通路分析及网络构建

将1.2获取的知母皂苷A-Ⅲ抗NPC作用靶点输入DAVID数据库进行GO功能注释和KEGG通路富集分析，并整合化合物、通路和靶点蛋白绘制“化合物-关键靶点-通路-疾病”网络图。

2 结果

2.1 知母皂苷A-Ⅲ的靶点预测

通过Swiss Target Prediction数据库获取知母皂苷A-Ⅲ所有靶点，规范化后获得81个潜在靶点。

2.2 NPC相关疾病靶点的获取和交集靶点的确定

在GeneCards数据库获取NPC疾病相关基因1758个，与知母皂苷A-Ⅲ的预测靶点相互映射，通过Venny平台取交集，获得知母皂苷A-Ⅲ抗NPC作用交集靶点31个，见图1。

图1 知母皂苷A-Ⅲ与NPC相关靶点韦恩图

2.3 知母皂苷A-Ⅲ与NPC相关靶点蛋白质互作网络（PPI）的构建

该网络包含30个节点（Nodes）和116条边（Edges），该圆形节点代表知母皂苷A-Ⅲ抗NPC的相关靶点蛋白，其按度值（Degree）逆时针排列，边代表不同靶点蛋白的相互作用关系，见图2。

图2 蛋白质相互作用（PPI）网络图

2.4 GO功能注释

GO功能富集分析结果显示，生物过程（biological process，BP）55条，主要涉及药物反应、基因表达、转录调控、细胞增殖和凋亡过程等方面；细胞组成（cellular component，CC）10条，涉及细胞膜、核浆和膜筏等方面；分子功能（molecular function，MF）13条，涉及药物结合、蛋白质结合、酶结合和酶活性等方面；依据P＜0.01，按照P值升序排列结果前15条显著富集的条目，见图3。

图3 知母皂苷A-Ⅲ抗NPC GO功能注释

2.5 KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析结果显示，显著富集的通路是蛋白多糖通路（proteoglycans in cancer）、癌症信号通路（pathways in cancer）、PI3K-Akt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、HIF-1信号通路（HIF-1 signaling pathway）、Rap1信号通路（Rap1 signaling pathway）和病毒致癌通路（viral carcinogenesis）等12条通路。见图4。

图4 知母皂苷A-Ⅲ抗NPC KEGG通路富集分析

2.6 “化合物-关键靶点-通路-疾病”网络图的构建

该网络包含91个节点（nodes）和374条边（edges），其中圆形节点代表关键靶点，正三角形节点代表通路，见图5。

图5 “知母皂苷A-Ⅲ-靶点-通路-疾病”网络图

3 讨论

NPC与多种危险因素相关，包括人类疱疹病毒（EB病毒）感染、遗传因素和环境因素[6]。我国NPC发病率居全球首位，年发病率约为每10万人30例[7]，NPC放疗后复发、转移和严重并发症等问题丞待解决。目前，常用顺铂等常规化疗药治疗，但其有多种严重副作用，近年来，中医药在防治肿瘤上备受关注。现代药理研究表明知母具有抗病原微生物、抗肿瘤和抗衰老等作用，知母皂苷A-Ⅲ是其药理活性最主要的成分。本研究基于网络药理学多靶点、多通路的研究思路，构建知母皂苷A-Ⅲ抗NPC的作用网络，预测关键靶点和通路，从而推测知母皂苷A-Ⅲ抗NPC作用机制。

通过对“知母皂苷A-Ⅲ-靶点-通路-疾病”网络图分析，发现蛋白激酶C（PRKCA）、胰岛素样生长因子1受体（IGF1R）和血管内皮生长因子A（VEGFA）是网络中的关键靶点，PRKCA是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，发现在肺癌[8]，经胶质神经瘤[9]，非小细胞肺癌细胞系[10]中上调，调节细胞增殖、侵袭和迁移等生物学行为。IGF1R通过引发Ras/Raf/MAPK（膜受体酪氨酸蛋白激酶信号传递途径）和磷脂酰肌醇激酶（PI3K）等信号级联反应参与癌细胞的增殖、凋亡、分化和恶性转化等调控[11]，研究显示NPC C666-1细胞系中IGF1R高度上调[12]，促进细胞的侵袭和增殖能力。同时，靶向抑制IGF1R可以阻滞细胞周期和诱导凋亡抑制NPC细胞增殖，并且可以使NPC细胞放射敏感性增高[13]。血管内皮生长因子（VEGF）诱导的基质金属蛋白酶（MMPs）不仅通过降解内皮细胞外基质而参与新血管的形成，而且还调节癌症的侵袭和转移，从而导致NPC的发生发展[14-15]。Chen等[16]发现抑制VEGFA表达水平可以抑制NPC CNE2细胞系侵袭能力并增强NPC放射敏感性。因此推测，知母皂苷A-Ⅲ可能通过单独或共同调节PRKCA、IGF1R和VEGFA，抑制NPC的增殖、分化、侵袭迁移和放疗增敏达到抗NPC的目的。

GO结果表明，知母皂苷A-Ⅲ是通过药物结合、蛋白质结合等作用于细胞膜、核浆和膜筏等部位调控基因表达、转录调控、细胞增殖和凋亡过程，预示知母皂苷A-Ⅲ通过调控上述生物过程抑制NPC的发生和发展。KEGG结果显示PI3K-Akt（磷脂酰肌醇激酶-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶）通路显著性较高，其异常激活与NPC的发生发展密切相关，研究表明，miR-155通过激活PI3K-Akt，促进NPC CNE2细胞的增殖和侵袭[17]，雷公藤甲素通过抑制PI3K-Akt上调半胱天冬酶3剪切带（cleavedcaspase-3）和凋亡调节蛋白（Bax），下调Bcl-2抑制NPC C666-1细胞增殖并诱导其凋亡[18]，野鸦椿酸可通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（PI3K-AKTmTOR）上调Bax和caspase-3，下调凋亡调节蛋白（Bcl-2）和周期蛋白-D1（cyclin D1）阻滞细胞周期在G1/ S期并诱导NPC细胞凋亡[19]。本研究结果表明，知母皂苷A-Ⅲ可能通过调节PI3K-AKT信号通路抗NPC。

目前NPC化疗药物顺铂常伴有肝肾毒性、骨髓抑制和严重的胃肠道反应，PI3K-Akt信号通路抑制剂LY294002以时间依赖性方式对正常细胞显示毒性[20]，因此也不能成为NPC患者的临床用药。知母作为我国的传统中药历史悠久，《中华人民共和国药典》记载知母具有清热泻火、生津润燥的功效，知母皂苷A-Ⅲ是知母的主要成分，综上所述，本研究基于网络药理学的分析方法，揭示知母皂苷A-Ⅲ抗NPC是一个涉及多靶点、多通路的共同作用过程，推测知母皂苷A-Ⅲ可通过PRKCA、IGF1R和VEGFA等多个核心靶点及蛋白多糖癌症通路、癌症信号通路和PI3K-Akt信号通路干预NPC的发生发展，提示其可能起到缓解症状、减毒增效和提高患者生存质量的作用，可作为NPC患者治疗干预的良好中药。

本研究也存在不足，中药单体是多靶点、多通路综合作用的结果，由于数据库不完善以及计算机无法真实模拟体内环境，因此本研究着重于理论分析，后期仍需要更多动物实验临床验证，但这为后续实验提供理论依据，指明研究方向。