丹参对脑缺血再灌注损伤脑组织中p-Akt、Caspase-3和HIF-1α蛋白的影响

袁春华 程谟鑫 李 影 程谟国

牡丹江医学院第二附属医院神经内二科，黑龙江牡丹江 157009

缺血性脑血管病注重早期溶栓治疗，使局部血液供应恢复正常，但再灌注将进一步加重缺血组织的损伤。再灌注损伤主要以神经细胞凋亡为主[1-2]。研究发现磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine kinase，Akt）是促进细胞存活的重要信号通路，在脑缺血再灌注过程中能够减轻对神经细胞的损伤，促进神经元细胞存活作用[3-5]。研究发现丹参具有改善微循环、抗血栓、抗氧化、促进组织恢复等作用[6-7]。丹参对脑缺血再灌注损伤的临床疗效明确，但是否通过激活PI3K/Akt转导通路对抗脑缺血再灌注引起的神经细胞损伤尚不明确。通过动物实验研究观察丹参对脑缺血再灌注损伤神经功能和脑梗死体积影响及对脑组织中磷酸化AKT蛋白（phosphorylated Akt protein，p-AKT）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）和缺氧诱导因子-1α（Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）表达情况，探讨丹参治疗脑缺血再灌注损伤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

2020年3—5月，选择48只健康SD大鼠，体重为（240±10）g，由牡丹江医学院实验动物中心提供，实验前适应性饲养观察3 d。将大鼠随机分为假手术组、模型组、丹参组和LY294002组，每组12只。所有实验动物操作均符合实验动物伦理学要求。

1.2 方法

1.2.1 药品及试剂 LY294002（美国Sigma公司），兔抗大鼠 p-Akt 多克隆抗体，兔抗大鼠 Caspase-3 多克隆抗体，兔抗大鼠 HIF-1α多克隆抗体（北京博奥森生物公司），辣根酶过氧化物酶标记山羊抗兔购于北京中杉金桥，丹参购于牡丹江市同仁堂大药房。

1.2.2 丹参提取物制备 参考文献[8]，将丹参药材（丹参产品批号：00126254）40℃烘干，粉碎成干粉，然后加入10倍量水，提取2次，每次45 min。过滤，弃滤渣，滤液合并，过滤；溶液定容至100 ml，2000 r/min离心10 min。取上清液，将浓度调整为2.5 mg/ml备用。

1.2.3 给药方法 丹参组灌胃给予丹参水提物进行干预，剂量为每天20 mg/kg，相当于60 kg成人的用药20倍。LY294002组肌内注射给予PI3K/Akt抑制剂LY294002（产品批号：10064321）剂量为每天2.5 μg/kg。假手术组和模型组灌胃给予丹参水提物同体积生理盐水，均给药7 d。

1.2.4 脑缺血再灌注模型建立 给药7 d后，各实验组动物按照Longa线栓法改良制作大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤模型[9]。称量大鼠重量，按体重腹腔注射给予10%水合氯醛进行麻醉，颈前术区脱毛、消毒，沿颈部正中线切开皮肤，逐层分离暴露分离右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，结扎颈总动脉和颈外动脉，用动脉夹夹闭颈内动脉远心端后，在颈内动脉上距离颈总动脉分叉处约2 mm处做一切口，从切口插入备好线栓，经切口处插入大脑中动脉始端，栓塞大脑中动脉，造成局灶性脑缺血。缺血2 h 后拔除栓线实施再灌注24 h。假手术组暴露右侧颈总动脉，不做其余处理。

1.3 评价方法

1.3.1 神经行为学评分 按照Longa 5分制评分标准[9]进行神经功能缺失程度评分。0分：无神经功能缺失症状，活动正常；1分：不能完全伸展对侧前爪；2分：出现向对侧转圈；3分：行走时身体向偏瘫侧倾倒者；4分：不能自发行走，意识丧失者。

1.3.2 脑梗死体积测定 取缺血再灌注后脑组织，-20℃冷冻30 min，去除小脑、低位脑干及嗅球，脑组织从额极向后做连续冠状切片5片，置于含2%的TTC的磷酸盐缓冲液中，37℃恒温箱孵育染色30 min，置于4%多聚甲醛固定24 h 后拍照。正常脑组织为红色，梗死灶为白色，采用图像分析软件分析计算脑梗死体积百分比。

1.3.3 大脑组织p-AKT、Caspase3和HIF-1α水平检测 取缺血侧大脑组织100 mg置于1 ml组织细胞裂解液中，超声细胞破碎仪低温匀浆。12000 r/min 4℃离心15 min，取上清，取2 μl蛋白溶液利用Direct Detect™ Spectrometer-Sample Measuring红外微定量分析仪直接检测蛋白浓度，取相同蛋白进行上样经SDS-PAGE电泳分离，将蛋白转移至PVDF膜上，转膜结束后，TBS-T洗膜2次，10 min/次，5%脱脂奶粉室温孵育2 h后，加入p-AKT、Caspase3和HIF-1α一抗工作液，4 ℃过夜，TBS-T缓冲液洗膜5次，10 min/次，加入二抗工作液，室温孵育1 h，TBS-T洗膜5次，10 min/次，采用ECL法显色。凝胶成像系统拍照并分析。

1.4 统计学分析

采用SPSS 19.0进行统计学分析，所有数据用（）表示，四组间比较采用F检验，组间两两比较采用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组神经功能评分、脑梗死体积比较

造模后，假手术组神经功能评分、脑梗死体积均为0；LY294002组神经功能评分最高，脑梗死体积最大，其次为模型组，丹参组最低，组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组神经功能评分、脑梗死体积比较（±s）

表1 各组神经功能评分、脑梗死体积比较（±s）

注：神经功能评分：丹参组与模型组比较，t=2.095，P=0.048，LY294002组与模型组比较，t=2.750，P=0.012，LY294002组与丹参组比较，t=5.906，P=0.000；脑梗死体积：丹参组与模型组比较，t=6.318，P=0.000，LY294002组与模型组比较，t=2.431，P=0.024，LY294002组与丹参组比较，t=8.592，P=0.000

组别 n 神经功能评分（分） 脑梗死体积（%）假手术组 12 0.00±0.00 0.00±0.00模型组 12 1.83±0.68 21.63±3.16丹参组 12 1.33±0.47 14.68±2.13 LY294002组 12 2.50±0.50 24.97±3.56 F值 57.583 216.530 P值 0.000 0.000

2.2 丹参对脑缺血再灌注损伤脑组织中p-Akt、Caspase-3和HIF-1α蛋白影响

脑组织中存在基础的p-Akt和HIF-1α分泌，脑缺血再灌注后p-Akt和HIF-1α表达明显增加；与假手术组比较，模型组脑组织中p-Akt和HIF-1α表达明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，丹参组脑组织中p-Akt和HIF-1α表达明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，LY294002组脑组织中p-Akt表达明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1A、B。与假手术组比较，模型组脑组织中Caspase-3的表达明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，丹参组脑组织中Caspase-3的表达明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，LY294002组脑组织中Caspase-3表达明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1C。

图1 脑缺血再灌注损伤脑组织中p-Akt、Caspase-3和HIF-1α蛋白表达

3 讨论

脑缺血再灌注恢复缺血区域血液供应将会进一步加重组织损伤和功能障碍。本研究发现预处理给予丹参后能够明显降低脑缺血再灌注对神经功能损伤，降低脑梗死体积百分比，提示丹参对脑缺血再灌注损伤具有保护作用；同时预处理给予PI3K/Akt通路抑制剂LY294002能够明显增加脑缺血再灌注对神经功能损伤，增加脑梗死体积，提示抑制PI3K/Akt通路的激活能够加重脑缺血再灌注损伤。PI3K/Akt信号通路是膜受体信号向细胞内转导的重要途径，对于维持细胞的生存和抑制细胞凋亡起关键作用，Akt是PI3K下游信号通路的主要靶点，处于中心环节，活化的Akt是发挥抗凋亡作用的关键，具有抑制多种刺激引起的细胞凋亡作用[10-11]。本研究发现建立局灶性脑缺血再灌注模型能够明显增加p-Akt的表达，提示脑缺血再灌注能够激活PI3K/Akt转导通路；预处理给予丹参能够极显著增加p-Akt的表达，提示丹参能够在脑缺血再灌注过程中激活PI3K/Akt转导通路。

HIF-1α是在特定的缺氧条件下广泛存在的一种缺氧应答调控因子，通过转录及转录后的调控，使机体适应缺血或缺氧坏境，同时研究证明HIF-1α在细胞凋亡过程中起着关键作用[12-13]。本研究发现在脑缺血再灌注过程中HIF-1α的表达明显高于假手术组，提示脑缺血再灌注过程中HIF-1α表达增加；预处理给予丹参在脑缺血再灌注过程中HIF-1α的表达明显高于模型组，提示给予丹参能够进一步激活HIF-1α的表达。

Caspase-3是细胞凋亡的关键酶和执行者，细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经途径[14-15]。本研究发现给予丹参预处理后脑缺血再灌注后Caspase-3表达明显低于模型组，提示丹参能够明显降低脑缺血再灌注损伤引起神经细胞的凋亡；给予LY294002阻断PI3K/Akt通路的激活能够明显增加Caspase-3表达，提示阻断PI3K/Akt通路促使神经细胞凋亡。

本研究以局灶性脑缺血再灌注模型为研究对象，通过观察丹参和PI3K/Akt通路阻断剂LY294002对脑缺血再灌注神经功能缺损和脑梗死体积影响表明丹参能够改善脑缺血再灌注神经功能缺损，降低脑梗死体积，增加脑组织中p-Akt和HIF-1α蛋白的表达，降低脑组织中Caspase-3表达，其作用机制可能为丹参激活PI3K/Akt转导通路，增加p-Akt和HIF-1α蛋白的表达，降低Caspase-3表达有关。本研究未分析丹参中发挥缺血再灌注脑组织保护作用的具体成分，期待今后研究中能够进一步分析。