Middlebrook7H11斜面培养基分枝杆菌培养效果评价

钱雪琴， 卢洪洲

（1. 上海市公共卫生临床中心检验医学科，上海 201508；2. 上海市公共卫生临床中心感染与免疫科，上海 201508）

结核病是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的慢性感染性疾病，分枝杆菌培养是诊断结核病的金标准。如何提高临床样本中分枝杆菌培养阳性率、缩短培养时间，是提高结核病防治效率的关键。培养基的选择是影响培养阳性率和报阳时间的直接因素。目前，分枝杆菌培养常用的培养基分为液体培养基和固体培养基两大类。液体培养基培养时间短，分枝杆菌培养阳性率高，但需要配备昂贵的检测系统，我国基层医院尚不具备广泛使用的条件。固体培养基根据固化剂种类可分为以罗氏培养基为代表的鸡蛋培养基和以Middlebrook7H11为代表的琼脂固体培养基。目前，我国临床实验室主要使用的是罗氏培养基，Middlebrook7H11仅用于科研。国外关于以罗氏培养基为对照，使用Middlebrook7H11平板培养基分离分枝杆菌，再通过显微镜观察结果的报道很多，但对于Middlebrook7H11斜面培养基的使用情况，国内外均鲜有文献报道。本研究将不同类型临床样本分别接种于Middlebrook7H11斜面培养基和罗氏培养基，比较2种培养基分枝杆菌培养阳性率、污染率及报阳时间的差异。

1 材料和方法

1.1 样本来源

收集2014年5月4日—7月3日上海市公共卫生临床中心住院和门诊患者各类临床样本599例，其中呼吸道样本415例（痰液样本374例、灌洗液样本22例、支气管刷取物样本19例）、其他体液样本159例（穿刺液样本37例、尿液样本29例、胃液样本27例、胸腔积液样本18例、脓性分泌物样本18例、脑脊液样本22例、引流物样本5例、腹腔积液样本3例）、粪便样本21例、肺组织和骨髓样本各2例。

1.2 病例分类

599例患者中，临床拟诊为陈旧性肺结核72例、肺结核41例、肺外结核65例、肺部感染167例、肺部阴影20例、淋巴结炎37例、艾滋病48例、肺癌和支气管扩张等其他疾病149例。肺结核的诊断标准为：以病原学（包括细菌学、分子生物学）检查结果为主，结合流行病史、临床表现、胸部影像、相关辅助检查及鉴别诊断等进行综合分析作出诊断；以病原学、病理学结果作为确诊依据；儿童肺结核的诊断除痰液病原学检查结果外，还要参考胃液病原学检查结果[1]。

1.3 培养基

Middlebrook7H11干粉培养基购自美国BD公司。（1）Middlebrook7H11斜面培养基配制。添加营养增强剂（油酸、牛血清蛋白、右旋糖苷、触媒），每管7～9 mL，倾斜放置，凝固后放入冰箱避光冷藏保存，有效期为1个月。（2）Middlebrook7H11斜面培养基性能验证。抽取2%～5%新批号培养基，（36±1）℃孵育，48 h后观察是否有细菌生长，无培养物生长为无菌性测试合格；如果发现任何一支培养基有培养物生长，则将同一批次的所有培养基（36±1）℃孵育48 h，逐一检查，弃去有细菌生长的培养管，将没有培养物生长的培养管拧紧螺盖保存备用；另取2管分别接种结核分枝杆菌H37Rv、胞内分枝杆菌进行生长试验，挑取菌落至磨菌容器，加入无菌0.9% NaCl溶液1～2滴，研磨后加入0.9% NaCl溶液制备成0.5麦氏单位菌悬液；使用校准后的接种环或移液管取10 μL菌液进行接种，于35℃～37℃、5%～10% CO2环境孵育，培养21 d；21 d后有菌落生长，抗酸染色排除污染为试验合格。标准菌株结核分枝杆菌（ATCC 27294）、包内分枝杆菌（ATCC 13950）购自上海市疾病预防控制中心。罗氏培养基由上海市疾病预防控制中心配送，批准文号为沪械注准20162400085。

1.4 方法

1.4.1 样本处理 按照BACTEC 960全自动分枝杆菌培养系统（美国BD公司）操作手册要求处理样本。稀薄痰、灌洗液、支气管刷取物、穿刺液等液态样本用2% NaOH-N-乙酰半胱氨酸按1∶1比例处理；黏稠痰、尿沉渣、脓性分泌物等黏稠样本采用NaOH与样本按3∶1比例处理；粪便样本取绿豆大小，加入蒸馏水10 mL，震荡混匀后静置15 min，取上清5 mL，加入3倍体积的NaOH处理。将处理后的样本涡旋震荡30 s，消化15～20 min，加含有100 U/mL青霉素的蒸馏水至50 mL，3 000×g离心15 min，弃上清，沉淀物加1 mL含有100 U/mL青霉素的蒸馏水混匀，待接种。

1.4.2 接种、培养 取0.1 mL处理后的临床样本，分别接种于Middlebrook7H11斜面培养基和罗氏培养基，置37 ℃温箱培养，接种后第3、7天各观察1次菌落生长情况，以后每周观察1次，8周未见生长视为阴性。

1.4.3 结果分级报告 参照《结核病实验室检验规程》[2]标准，以菌落生长不足斜面1/4为分枝杆菌培养阳性（X个菌落），菌落生长占斜面1/4为分枝杆菌培养阳性（1+），菌落生长占斜面1/2为分枝杆菌培养阳性（2+），菌落生长占斜面3/4为分枝杆菌培养阳性（3+），菌落生长铺满斜面为分枝杆菌培养阳性（4+），培养8周仍无菌落生长为分枝杆菌培养阴性。

1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。采用χ2检验比较2种培养基分枝杆菌培养阳性率、污染率、阳性早出现例数的差异。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2种培养基培养结果比较

599例临床样本中，Middlebrook7H11斜面培养基培养阳性率为12.9%，罗氏培养基培养阳性率为12.4%，两者联合培养阳性率为15%。Middlebrook7H11斜面培养基培养阳性率稍高于罗氏培养，但差异无统计学意义（χ2=0.07，P>0.05）；罗氏培养基污染率高于Middlebrook7H11斜面培养基（χ2=4.67，P＜0.05）；同一样本Middlebrook7H11斜面培养基培养阳性早出现1周的例数多于罗氏培养基（χ2=11.62，P＜0.01），阳性培养时间缩短1周；Middlebrook7H11斜面培养基同一样本菌落数稍多于罗氏培养基，但差异无统计学意义（χ2=2.66，P>0.05）。见表1、表2、表3。

表3 2种培养基培养结果一致性比较 例

2.2 374例痰液样本2种方法培养结果比较

347例痰液样本Middlebrook7H11斜面培养基培养阳性率为12.6%，罗氏培养基培养阳性率为12.0%，两者联合培养阳性率为14.7%。Middlebrook7H11斜面培养基与罗氏培养基之间阳性率差异无统计学意义（χ2=0.05，P>0.05）。见表4。

表4 374例痰液样本2种培养基培养结果一致性比较 例

2.3 不同疾病类型2种培养基阳性结果比较

所有类型疾病中，肺部阴影培养阳性率最高，其次为淋巴结炎及肺部感染，陈旧性肺结核阳性率最低。见表5。

表5 不同疾病类型2种培养基培养阳性结果比较

3 讨论

分枝杆菌培养基分为液体培养基、固体培养基和液/固双相培养基。Middlebrook7H9培养基为常用液体培养基。20世纪70年代发展起来的以Middlebrook7H9培养基为基础的自动化培养系统，包括有放射性的BACTEC460培养体系和无放射性的MB/BacT Alert 3D、BACTEC Myco/Flytic、BACTEC MGIT 960、VersaTREK培养系统，通过测定细菌生长代谢来检测分枝杆菌。BACTEC460培养体系由于存在放射性，已不再使用。其他商品化的液体培养检测系统因仪器及试剂价格昂贵，基层医院很少使用。与固体培养基相比，液体培养基提高了分枝杆菌检出率。CRUCIANI等[3]对10项研究中分离自14 745例临床样本的1 381株分枝杆菌进行了Meta分析，发现MGIT系统的分析灵敏度为81.5%，而罗氏培养基的灵敏度为67%。SIMNER等[4]报道MGIT系统结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌（non-tuberculosisMycobacterium，NTM）平均报阳时间分别为10 d和14 d，Middlebrook7H11琼脂平板培养时间分别为20 d和23 d。

固体培养基主要分为以鸡蛋为基础和以琼脂为基础的2类培养基。以鸡蛋为基础的培养基使用最广泛的是罗氏培养基，具有很好的缓冲能力，可以保存较长时间（数月），培养基中所含的孔雀绿可抑制杂菌生长，不需要特殊的仪器，用于MTB培养效果较好，但牛分枝杆菌生长不佳，用丙酮酸钠代替培养基中的甘油，可以促进牛分枝杆菌的生长。以琼脂为基础的培养基主要有Middlebrook7H11和Middlebrook7H10，其主要成分为琼脂、有机化合物、氯化钠、甘油和白蛋白，可用于分枝杆菌的分离培养和药物敏感性试验。Middlebrook7H11在Middlebrook7H10的基础上进行了改良，通过添加0.1%的酪蛋白水解物，用于在Middlebrook7H10琼脂上因苛养生长不良或异烟肼耐药的MTB的培养[5]。琼脂培养基最大的优点是培养基凝固后完全透明，当样本被接种到含有该种培养基的平皿后，10～12 d就可以通过普通光学显微镜或解剖镜观察到MTB菌落生长，而罗氏培养基需要18～24 d才出现肉眼可见的菌落[6]；缺点是保存时间较短（1个月），过度加热和光照会释放甲醛，对分枝杆菌有毒性。

BATTAGLIOLI等[7]发现罗氏培养基分枝杆菌敏感性为76%，低于Middlebrook7H11平板培养基（8 6%）。I D I G O R A S等[8]以罗氏培养基为对照，应用显微镜观察Middlebrook7H11平板培养结果，比较两者阳性率及报阳时间，罗氏培养基培养阳性率为4.9%（265/5 438），Middlebrook7H11平板培养基阳性率为4.2%（227/5 438），两者比较差异无统计学意义（P>0.05）；Middlebrook7H11平板培养平均检出时间为12 d，而罗氏培养基平均检出时间为23 d。本研究使用Middlebrook7H11斜面培养基，每周肉眼观察，以出现针尖样菌落后涂片抗酸染色阳性为标准，结果显示Middlebrook7H11斜面培养基阳性率为12.9%，罗氏培养基阳性率为12.4%，两者比较差异无统计学意义（P>0.05），与文献报道[8]结果一致。本研究结果表明，Middlebrook7H11斜面培养基阳性最早检出时间是11 d，中位时间是28 d，平均为31 d；罗氏培养基阳性最早检出时间为12 d，中位时间为30 d，平均为31 d，与文献[8]比较，阳性时间有所延长。本研究有12例样本Middlebrook7H11斜面培养基阳性时间与罗氏培养基相比缩短1周。THARMALINGAM等[9]将107例涂片阳性样本同时采用罗氏培养基和Middlebrook7H11平板培养基进行培养，其中106例在2种培养基上均生长；Middlebrook7H11平板培养后通过显微镜观察结果，有51例（48.1%）样本1周内发现有菌落生长，其余样本2周之内全部发现有菌落生长；而罗氏培养基菌落最早生长时间为14 d，有12例（11.3%）样本2周才开始有菌落生长，5周内有79例（74.5%）样本有菌落生长。本研究使用Middlebrook7H11斜面培养基，2周内仅4例（5.2%）样本有菌落生长，远低于文献报道[9]的结果。

本研究未采用Middlebrook7H11平板培养基进行培养，是基于分枝杆菌固体培养需要8周时间，考虑到平板培养基在培养过程中易干燥，显微镜观察增加了生物安全的危险性和实验室人员工作量，故将琼脂培养基做成了斜面，肉眼观察培养结果。本研究的局限性是样本接种于培养基后，按照《结核病实验室检验规程》[2]规定，第3、7天各观察1次菌落生长情况，以后每周观察1次，没能做到每天观察菌落，记录的菌落生长时间可能要晚于实际菌落生长时间。考虑到临床检测工作与科研工作的差别，本研究的菌落生长时间仅代表临床检测工作中分枝杆菌生长时间。

本研究发现，Middlebrook7H11斜面培养基污染率（5.3%）低于罗氏培养基（8.5%），与文献报道[5]一致。可能由Middlebrook7H11培养基成分相对简单，一些苛氧菌生长不良所致。

目前，临床实验室中常用的双相培养基包括Middlebrook7H11斜面/Middlebrook7H9肉汤和罗氏斜面/Middlebrook7H9肉汤。与固体培养基相比，双相培养基可缩短分枝杆菌培养时间，提高培养的阳性率。 GHATOLE等[10]对双相培养基（Middlebrook7H11斜面/Middlebrook7H9肉汤）与罗氏培养基进行比较，涂阳样本双相培养基阳性率为97.0%，报阳时间为（21.00±4.44）d；罗氏培养基阳性率为79.41%，报阳时间为（28.00±3.76）d；双相培养基污染率较低（1.33%），对MTB的分离效果优于罗氏培养基。本研究仅使用了Middlebrook7H11斜面培养基，阳性率与罗氏培养基比较差异无统计学意义（P>0.05），报阳时间长于双相培养基。

液体培养基可提高分枝杆菌培养阳性率，缩短培养时间。Middlebrook7H11平板培养后通过显微镜观察结果，可显著缩短分枝杆菌阳性检出时间，但存在生物安全隐患、培养基易干燥、结果观察步骤繁琐等弊端。配制成斜面，可避免上述情况发生，但延长了报阳时间。与罗氏培养基相比，Middlebrook7H11斜面培养基对于一部分阳性样本可提前1周报告病原菌结果。Middlebrook7H11斜面培养基和罗氏培养基在分枝杆菌培养中具有互补性，两者联合可提高分枝杆菌培养的阳性率，缩短部分样本阳性报告时间。综合文献及本研究结果，我们认为理想的分枝杆菌培养组合为Middlebrook7H11平板培养基、罗氏培养基和MGIT 960 3种培养基联合培养。