医院内感染中铜绿假单胞菌与秀丽隐杆线虫互作模型的运用研究＊

文/邹伟，张新乐，邓文航，白自桐，陈玉婷

病原细菌对现有抗生素的耐药性不断增强是公共卫生管理的一大障碍，其中医院感染的病原菌中，铜绿假单胞菌占57%。大医院疾病患者中，囊性纤维化患者以及烧伤引起免疫低下患者更易感染铜绿假单胞[1]，对人体健康危害极大，治疗困难、代价高。多数抗生素作用于细胞生长的过程发挥杀菌功能，然而在治疗的过程中，病原菌发生基因突变表现出适应对抗生素的耐受性，逐渐适应抗生素，导致抗生素耐药菌株的产生，从而加剧治疗难度[2]。因此，寻找替代传统抗生素治疗的方法应对细菌耐药性迫在眉睫。在许多耐药细菌物种中，各种毒力因子的产生和群体感应（QS）细胞间通信机制调控密切相关。QS调节系统使细菌群体能发起对宿主免疫的防御反应，保护自身免受抗感染药物等杀灭[3]。靶向作用于QS系统克服了耐药性问题，因此筛选作用于QS系统的药物是抗铜绿假单胞菌药物筛选的新方向。此外，在学习记忆机制研究中也取得较好进展，通过该模型研究秀丽隐杆线虫的记忆、遗忘等行为参与的神经元及调控机制也逐渐受到关注。

1 靶点作用于群体感应系统药物筛选

细菌群体感应（QS）是指细菌利用营养物质促进群体生长繁殖使群体数量和密度快速增加，从而表现出与个体生理反应不一致的群体行为。其调控的具体机制为群体数量和密度增加后，伴随着信号分子的浓度也增加，进而将信号传递给受体蛋白进一步传递胞内，正调控（激活）或者负调控（抑制）特定基因的表达，达到调控微生物群体生理变化的目的。机会性致病病原体的QS调控系统包含3种不同类型，分别是las、rhl和pqs系统，调控病原体致病因子的产生[3]，因此是开发新型抗菌药物的重要靶点。根据群体感应原理存在一些干扰其运行的机制，主要有三类方法。第一类干扰方法是分解群体感应系统中的信号分子，内酯酶可水解ahl的内酯键，生成酰基高丝氨酸生物活性大大降低从而不能与受体蛋白结合，破坏细菌的Qs体系；第二类干扰方法是抑制Al的生成，切断Qs信号通路；第三类干扰方法是通过合成AI的结构类似物，与相应的受体蛋白竞争性结合，破坏信号通路的传递。植物源五环三萜、桦木脂素和桦木脂酸具有广泛的生物活性，是治疗铜绿假单胞菌感染的有效物质，该化合物主要存在于桦木科植物、昆栏树树皮和酸枣种子中。桦木脂具有广泛的药理特性，包括抗菌、抗病毒、抗癌、抗炎和肝脏保护活性[4]。此外，该化合物通过降低胞外多糖的产生等特性抑制生物膜形成，作为QS系统受体、lasR和rhlr的强竞争性抑制剂，成为潜在的抗感染药物，用于控制铜绿假单胞菌的慢性感染[5]。

2 在铜绿假单胞菌毒力和耐药性研究中的运用

该模型用于筛选敏感药物的及抗菌机制，为联合用药提供了证据，有助于抗侵染化合物如四环素、利福平和多粘菌素B的筛选[6]。此外在铜绿假单胞菌侵染时，某些化合物能够增强线虫的先天免疫，如：陆生植物、内生真菌、海洋细菌和海藻的天然产物[7]。越来越多的植物提取化合物在抗病原菌感染中有效，主要作用机制是提高宿主免疫或者降低病原毒力。如对丁香花蕾抗铜绿假单胞菌活性的研究中发现，该活性物质可显著增强线虫免疫而抵抗病原菌侵染，可作为治疗耐药病原菌感染的潜在治疗活性物[8]。五环三萜类化合物通过降低胞外多糖的产生显著干扰生物膜发育的初始阶段，增加秀丽隐杆线虫的存活率[5]。此外，二甲双胍可以增强被侵染线虫先天免疫，从宿主的层面增强自身抵抗力产生对病原菌的高抵抗力。因此，二甲双胍可用于病原体侵染治疗[9]。虽然使用互作模型发现了一些治疗疾病的新化合物，探索了部分有效化合物的活性机制，但铜绿假单胞菌对秀丽隐杆线虫产生的耐药机制研究仍不足，是今后研究的重要方向。

3 在病原菌学习机制研究中的运用

以秀丽隐杆线虫作为模式生物，研究其对病原菌的记忆和遗忘机制得到广泛运用，线虫被病原细菌侵染后会产生记忆[10]。在NGM平板的两端分别加入线虫OP50食物和铜绿假单胞菌PA14，将线虫加至两种菌体的中间，更多的线虫爬至PA14菌斑中，表现出对PA14的喜爱[11]。干扰AWB和AWC神经元相应神经肽和受体基因表达，线虫对PA14偏好异常，表明AWB和AWC神经参与线虫对PA14气味偏好行为调控[12]。此外，线虫的PA14的偏好行为在外界的干扰下会发生反转，将同步化后生长至young adult的线虫放入涂满PA14菌斑中（确保线虫无法逃离菌斑）4 h后，进行偏好实验，当其再次嗅到PA14气味，表现出厌恶行为（更偏好于OP50）[10]。研究发现该行为的改变属于线虫对病原细菌的学习行为，PA14进入线虫体内并寄生繁殖破坏肠道，线虫感受伤害从而产生记忆，再次感知PA14气味后表现出逃避反应。该学习行为是由ADF神经元中的五羟色胺调控的。当线虫暴被PA14侵染后，神经系统做出反应，五羟色胺在ADF神经元中合成增加，释放后特异性的与AIZ和AIY中间神经元受体MOD-1结合，通过激活其他信号通路产生对病原菌的学习[11]（见图1）。

图1 秀丽隐杆线虫对病原菌记忆学习调控模式图

4 展望

在筛选铜绿假单胞菌敏感药物过程中，秀丽隐杆线虫侵染模型运用广泛，此外该模型还可用于协同药物筛选验证及作用机制研究，为联合用药提供证据。近年来分离到多种在侵染期间提高免疫免受侵染的化合物，发现治疗铜绿假单胞菌引起的慢性炎症疾病新靶点。虽然该模型得到了广泛运用，但许多铜绿假单胞菌侵染线虫模型背后的毒力机制仍然不是十分清晰，有待继续探索。此外线虫具有完整的神经元结构，神经元间可以实现信号传递，很多保守调控通路与哺乳动物同源，是研究学习、记忆和遗忘的较好模式生物。近年来，在学习和记忆方面的研究取得较多进展，但在病原遗忘行为的研究中鲜有报道。因此，病原遗忘的研究也是今后较好的选题。