芽孢杆菌与酵母菌和根霉曲混合发酵提高四甲基吡嗪含量的研究

吴钱弟，吴茗花，沈 毅，王 西，罗爱民

（1.四川大学轻工科学与工程学院，四川成都 610065；2.四川郎酒股份有限公司，四川古蔺 646523）

“曲乃酒之骨”[1]，大曲在白酒酿造过程中发挥着不可替代的作用。大曲不仅为白酒酿造提供丰富的微生物系和酶系，启动白酒的发酵过程，同时也为白酒带来多种香气成分[2-3]。

四甲基吡嗪是一种具有烘烤、甜香味的化合物[4]，也是白酒中的一种重要香气成分[5]。在日本纳豆[6]、发酵的可可豆中均能分离到四甲基吡嗪[7]，四甲基吡嗪赋予这些发酵食品重要的香气。除此之外，由于其对高血脂、高胆固醇的治疗作用，可预防心血管疾病等生理药理作用[8-9]，近年来，在健康白酒的大环境下，四甲基吡嗪已被广泛研究[10-11]。江南大学通过现代风味化学、微生物学与代谢工程等科学理论和先进技术手段确定了中国白酒中四甲基吡嗪的产生机制为：功能菌株糖降解产生丙酮酸，丙酮酸缩合生成α-乙酰乳酸，α-乙酰乳酸脱羧产生乙偶姻，发酵体系中的乙偶姻（Acetoin，ACT）和由氨基酸转化而来的氨经过非酶促反应生成四甲基吡嗪[12-13]。为探索白酒中四甲基吡嗪的来源，吴建峰[14]发现细菌麸曲是白酒中四甲基吡嗪的主要来源之一。因此，在工业生产中，提高大曲中的四甲基吡嗪含量有望提高白酒中的吡嗪含量。

大曲的发酵是一个开放式的多菌株协同发酵过程。在高温大曲发酵的前期，霉菌和酵母作为主要优势微生物，产生多种酶系和香气成分的前体物质为后期高温发酵提供了物质基础[15]。根霉曲已被证明具有较强的糖化力[16]，可促进糖酵解作用进而推动乙偶姻的产生，从而提高四甲基吡嗪的含量。毕赤酵母，除了具有产酒和产香的作用外，还有产酶和多种蛋白的作用[17]。在高温大曲发酵后期，温度达到40 ℃后，酵母菌已不适应其生长环境，菌体开始大量死亡变为丰富的蛋白资源，提供氮源[18]。本实验通过芽孢杆菌纯种发酵，芽孢杆菌和酵母菌，芽孢杆菌、酵母菌和霉菌混合发酵，模拟工厂大曲发酵过程，提高了曲样中四甲基吡嗪的含量。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

样品及原料：Bacillus licheniformis从高温大曲中筛得[19]，Pichia kudriavzevii从酱香型白酒酒糟中筛出[20]，均保藏于本研究室；根霉曲，安琪酵母股份有限公司；小麦粉、稻壳，四川郎酒厂。

试剂：四甲基吡嗪标准品（色谱纯），北京谱析-盛世康普；乙偶姻标准品（色谱纯），阿拉丁试剂公司；纳氏试剂，成都市科隆化学品有限公司。甲醇（色谱纯）等其他试剂均购于四川蜀都试剂公司。

仪器设备：THZ-98AB恒温振荡器，上海一恒科学仪器有限公司；HWS-150恒温恒湿试验箱，上海苏盈试验仪器有限公司；Agilent 1260型高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；安捷伦Poroshell 120 EC-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，4 μm），安捷伦科技有限公司；SW-CJ-JD型超净工作台，江苏净化设备有限公司；UV756型紫外分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司；JA1203电子天平，上海恒平科学仪器有限公司；TGL-15B离心机，上海安亭科学仪器厂；PHS-3C pH计，上海佑科仪器仪表有限公司；YM-1000CT超声仪，上海豫明仪器有限公司。

1.2 培养基制备

芽孢杆菌种子液培养基：酵母膏5 g，蛋白胨10 g，氯化钠10 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0～7.2，121 ℃灭菌20 min。

酵母菌种子液培养基：酵母膏10 g，葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，蒸馏水1000 mL，pH中性，121 ℃灭菌20 min。葡萄糖单独115 ℃灭菌15 min。

固态培养基：小麦粉和稻壳按10∶1的比例混合均匀，加入质量分数40%的蒸馏水，混匀，置于沸水上蒸30 min，蒸至不见生粉状态。再装入250 mL锥形瓶中（每瓶50 g），封口，121 ℃灭菌20 min。

1.3 实验方法

1.3.1 发酵实验

实验组别：A组：只接种芽孢杆菌；B组：芽孢杆菌与酵母菌同时接种；C组：先接种酵母菌，再接种芽孢杆菌；D组：先接种酵母菌和根霉曲，再接种芽孢杆菌。

种子液的制备：挑取一小环菌苔至种子培养基中，芽孢杆菌置于37 ℃下培养24 h，毕赤酵母置于30 ℃下培养48 h，振荡培养箱转速130 r/min，至OD600nm=2.0左右。

固态培养：在无菌条件下，待固态培养基灭菌冷却至室温后，A组：接种1 mL芽孢杆菌种子液至培养基中；B组：同时接种3 mL酵母菌种子液和1 mL芽孢杆菌种子液至培养基中；C组：先接种3 mL酵母菌种子液，发酵3 d后再接种1 mL芽孢杆菌种子液；D组：先同时接种3 mL酵母菌种子液和根霉曲粉末0.3 g，发酵3 d后再接种1 mL芽孢杆菌种子液。每组实验设置3个平行。模拟工厂制曲的温湿度变化，发酵条件为：1～2 d，30 ℃，90 %RH；3～4 d，37 ℃，95%RH；5～6 d，45 ℃，95%RH；7 d，55 ℃，95%RH；8 d，65 ℃，95%RH。

1.3.2 四甲基吡嗪和乙偶姻的测定

样品制备：称取样品10 g，加入无水CaCl20.1 g，60 %vol乙醇30 mL，在25 ℃下超声处理20 min（100 w，20 KHz），以8000 r/min离心10 min。取上清液过0.22 μm滤膜，待测。

四甲基吡嗪色谱条件：流动相为甲醇∶超纯水（0.05 %三氟乙酸）=7∶3，柱温30 ℃，检测波长278 nm，流速0.8 mL/min，进样量5 μL。

乙偶姻色谱条件：流动相为甲醇∶超纯水（0.05 %三氟乙酸）=3∶7，柱温30 ℃，检测波长278 nm，流速0.7 mL/min，进样量5 μL。

1.3.3 氨含量的测定

参考弓晓峰[21]的方法稍作修改：称取样品2 g，加入蒸馏水20 mL浸泡30 min，隔10 min搅拌1次，8000 r/min离心10 min，取上清液1 mL于50 mL容量瓶中，定容，再加入1 mL酒石酸钾钠溶液和1 mL纳氏试剂，摇匀，精确反应10 min后，用紫外分光光度计在波长390 nm处检测。用氯化铵作标品绘制标准曲线。

1.3.4 酸度和还原糖的测定

酸度采用电位滴定法，斐林试剂法测定还原糖[1]。

1.4 数据分析

每个试验均处理3个重复，用Excel和Origin（2019b）进行分析和作图。

2 结果与分析

2.1 四甲基吡嗪含量比较分析（图1）

图1 四组实验四甲基吡嗪含量比较分析

四组实验发酵结束时四甲基吡嗪的含量见图1。由图1可知，接种霉菌、酵母和芽孢杆菌的D组四甲基吡嗪含量最高，为881.5 μg/g；先后接种酵母和芽孢杆菌的C组四甲基吡嗪较低于D组，为493.9 μg/g；芽孢杆菌纯种发酵的A组四甲基吡嗪含量为293.6 μg/g；然而，同时接种酵母和芽孢杆菌的B组四甲基吡嗪含量最低，为150.1 μg/g。结果说明，同时接种酵母菌和芽孢杆菌会产生抑制作用[22]，从而影响四甲基吡嗪的生成。D组与C组比较可知，接种霉菌会较大的促进四甲基吡嗪的产生，这可能是由于霉菌在发酵前期产生了较大的糖化作用，因此提高了四甲基吡嗪的含量。D组和C组混菌发酵的结果明显优于A组纯种发酵，因此先后接种的混菌发酵有利于提高四甲基吡嗪的含量。

2.2 乙偶姻含量分析（图2）

图2 各组实验发酵乙偶姻含量的分析

四组实验发酵结束的乙偶姻含量见图2。由图2可知，C组乙偶姻含量为150.1 mg/g；D组乙偶姻含量略低于C组，为140.4 mg/g，A组和B组乙偶姻含量分别为99.4 mg/g和61.8 mg/g。结果表明，同时接种酵母菌和芽孢杆菌会相互抑制，使乙偶姻的生成量降低。但是，先后接种酵母菌和芽孢杆菌会促进乙偶姻的生成，C组乙偶姻含量为B组的两倍多。D组乙偶姻含量略低于C组，结合图2四甲基吡嗪的分析，可能是由于一部分乙偶姻已转化为四甲基吡嗪。A组纯种发酵乙偶姻的含量较低于C组和D组，表明酵母和霉菌在按先后接种顺序培养的条件下可以促进乙偶姻的生成，其结果明显优于纯种发酵。

2.3 氨含量分析（图3）

图3 四组实验发酵氨含量的分析

四组实验发酵结束时氨含量的结果见图3。氨作为四甲基吡嗪的又一重要前体物质，其主要来源于多种氨基酸通过氨基酸脱氢酶的转化[14]。氨含量的变化与乙偶姻相似，C组氨含量为5.7 mg/g，略高于D组5.3 mg/g，A组和B组氨含量分别为4.4 mg/g和3.6 mg/g。结果表明，先接种酵母菌和霉菌，再接种芽孢杆菌同样会促进氨的生成，同时接种反而会抑制氨的生成。D组氨含量低于C组，原因可能是氨与乙偶姻用于合成四甲基吡嗪，因此氨含量减少。

2.4 还原糖和酸度分析（图4）

还原糖通过糖酵解转化为丙酮酸，丙酮酸通过2-乙酰乳酸聚合酶（ALS）和2-乙酰乳酸脱羧酶（ALDC）作用下生成乙偶姻[12]。由图4a知，发酵结束时，C组和D组还原糖含量差别不大，D组略高于C组，其中A组和B组还原糖含量较低于C组和D组，且B组还原糖含量低于A组。结果说明，先后接种酵母菌和霉菌可促进还原糖的产生，这与酵母菌和霉菌在发酵前期的糖化液化的作用有关[23]。由图4b知，四组实验酸度的变化趋势与还原糖相似，一定的酸性环境可促进四甲基吡嗪的生成，这与以前的研究结果类似[24]。

图4 四组实验发酵还原糖（a）和酸度（b）的分析

2.5 乙偶姻、氨、还原糖和酸度对生成四甲基吡嗪的比较（图5）

图5 乙偶姻、氨、还原糖、酸度与四甲基吡嗪之间相关性分析

运用origin计算出乙偶姻、氨、还原糖、酸度和四甲基吡嗪之间相关性的大小。由图5可知，各因素之间的相关系数均大于0.75，说明彼此之间的相关性均较强。对四甲基吡嗪而言，酸度、还原糖和乙偶姻对其影响更大。酸度和还原糖对乙偶姻、氨的影响也较大。在发酵前期，霉菌和酵母产生多种酶类，将淀粉转化为还原糖，霉菌较强的糖化力和液化力有利于前期发酵过程淀粉的利用，随着发酵进行，酸性也越来越大，因此在发酵前期接种酵母菌和霉菌有利于四甲基吡嗪的生成。

3 结论

本研究通过四组实验模拟工厂制曲中四甲基吡嗪的产生情况。得出结论，D组四甲基吡嗪含量最高，为881.5 μg/g，其次是C组和A组，分别为493.9 μg/g和293.6 μg/g，B组四甲基吡嗪含量最低，为150.1 μg/g。乙偶姻和氨的含量变化相似，C组和D组差别不大，且明显高于A组和B组，其中C组略高于D组，A组较高于B组。C组和D组还原糖含量明显高于A组和B组，B组还原糖含量最低。C组和D组的酸度也高于A组和B组。四甲基吡嗪在白酒中的产生是通过功能菌株糖酵解、丙酮酸转化等发酵过程产生乙偶姻，氨基酸通过氨基酸脱氢酶生成氨，乙偶姻和氨再合成四甲基吡嗪。加入糖化力强的根霉曲有利于还原糖的生成，酵母菌在前期发酵过程会产生多种酶类，分解原料促进前体物质的生成，在发酵温度升高以后酵母菌体死亡作为氮源促进芽孢杆菌等耐热性细菌的生长。因此，本研究利用大曲发酵过程中微生物的作用特点，先接种酵母菌和根霉曲，再接种芽孢杆菌可提高大曲中四甲基吡嗪的含量，为多菌株协同发酵提高白酒中四甲基吡嗪的含量提供了思路。