G C指纹图谱结合多元统计分析筛选基酒评级关键化合物

许 涛，刘青茹，郑 蕾，刘光钱，张 芮，王松涛，沈才洪，张晓娟

（1.泸州品创科技有限公司，四川泸州 646000；2.泸州老窖股份有限公司，四川泸州 646000；3.江南大学生物工程学院，江苏无锡 214000）

泸（浓香）型大曲酒是多菌种固态发酵生产、酒醅蒸馏、分段摘酒等系列工序严格配合所得[1-2]。虽然基础酒所用酿造原料和生产工艺大致相同，但固态发酵影响因素众多[3-5]，每窖甚至每甑所产的基础酒在感官、风格特征方面存在一定差异[6]。因此，依据等级、风格等对其进行定级分类对于后续酒体设计和产品生产至关重要。然而，目前分类定级仍多采用传统感官评定的方式，按照评判标准以色、香、味、格进行综合评价。

白酒中1 %～3 %的微量成分主要包括醇类、酸类、酯类、醛酮类化合物等[7]，它们的组合决定了酒体的风格和品质[8-11]，例如，醇类主要表现出柔和的刺激感和微甜、浓厚的感觉，有时也会赋予酒体一定苦味；酯类是含量最多的一类，主要表现为微甜、略带涩味，并有一定刺激感，有些表现出苦味，泸型酒中酯类主要是乙酯类物质，大多表现为水果的芳香；酸类是重要的呈味物质，有促进新酒老熟，增长后味、消除苦味、杂味和抑制掩蔽香气的作用；醛酮类主要赋予酒体刺激感或辛辣感，同时也有促香或提香效应。因此，通过气相色谱（GC）采集基础酒中呈香呈味物质的组成与含量特征，以其指纹图谱结合多元统计分析能够从数字化信息层面为基础酒定级分类提供科学支撑[12-14]。此外，此方法标准化程度高、信息丰富、便于推广和应用。

本试验以专业的传统感官评定方式为分类定级参照，通过气相色谱法采集六类新收储浓香型白酒基酒的色谱数据，按保留时间一致的原则进行共有峰匹配后利用中位数法构建了6类不同等级浓香型白酒基酒的标准指纹图谱。利用偏最小二乘法-判别法（PLS-DA）建模，分析影响基础酒分类定级的因素。以探讨基础酒中挥发性组分对目前基础酒定级体系的影响。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

酒样：样品为泸州老窖每日收储的新基础酒。共计36个酒样。所取酒样均由专业的品评人员进行感官评定。定量分析时，以无水乙醇配制含2 %vol叔戊醇、2 %vol乙酸正戊酯与2 %vol 2-乙基正丁酸的3种内标混合液，然后按照定容体积10 mL酒样，添加0.1 mL内标液混匀即可供进样。

仪器设备：便携式酒度计，Agilent 6890 GC仪，FID检测器；数据处理采用Agilent 6890工作站；检测器与进样口的温度均为250 ℃。Agilent 5975I GC-MS，EI源，离子源温度180 ℃，接口温度200 ℃，电离电压70 eV。

1.2 试验方法

1.2.1 色谱条件

根据文献修改[8]，色谱柱为DB-Wax毛细管柱，柱长60 m，内径0.25µm。升温程序：初始柱温为30 ℃，保持6 min，以2.5 ℃/min升温至40 ℃，再以5 ℃/min升温至100 ℃，然后以10 ℃/min升温至200 ℃，再以20 ℃/min升温至220 ℃，保持10 min。载气为高纯氮气，流速为1.6 mL/min。进样口温度为230 ℃，采用分流模式进样，分流比为40∶1。检测器为FID检测器，温度为250 ℃。进样量为1 μL。

1.2.2 感官评定

3名省级尝评员进行品评定级，将36个样品分为6个等级。本实验对6类酒样的感官等级优劣次序依次为：I类（A）、II类（B）、III类（C）、IV类（D）、V类（E）、VI类（G）。为便于PLS-DA分析，本实验人工设置I类（A）=100～96分、II类（B）=95～91分、III类（C）=90～86分、IV类（D）=85～81分、V类（E）=80～76分、VI类（G）＜75分。

1.2.3 挥发性组分均值

采用共有模式图谱[16]，中位数矢量法算法[17]，公式如下：

中位数矢量=median(X1j，X2j，……Xij，……Xnj)

式中，Xij为当第i个样品的保留时间为j时的峰面积。

2 结果与讨论

2.1 各类基础酒酒精度

通过感官分析，对样品进行了等级分类，得到了不同类别的基酒。这些基酒具有各自的不同风格，I类与II类主要风格特点为浓香和窖香好，III类与IV类主要为香味淡、味偏短涩，而V类与VI类以粮香好、味嫩杂为主要风格特点[15]，对不同类别基酒的感官品评标准见表1。

表1 各类基础酒的感官品评语

6类不同类别基础酒的酒精度见表2。从I类至VI类基础酒酒精度有逐渐下降的趋势。I类基础酒酒精度最高在66 %vol～68 %vol之间。VI类基础酒酒精度最低在60%vol～62%vol之间。与先前研究结果[15]高度一致，生产具有良好的稳定性。

表2 各类别基础酒平均酒精度

2.2 各类别基础酒物质组成类别分析

2.2.1 各类物质总含量分析

糟醅在窖池的发酵过程不仅是产酒更是产酯生香的过程，发酵过程中产生的醇、酸、酯等化合物之间相互作用此消彼长最终达到动态平衡[18]。如图1(a)、(b)所示，随基础酒等级降低，其总酸、总酯含量均整体呈现下降趋势，其中第IV类基础酒酸类物质略有回升，而酯类物质骤降。从图1(c)可以看出，第V类基础酒醇类物质含量最高，第IV类基础酒醇类物质含量最低。醇类物质总含量在6类基础酒中从I类基础酒至IV类基础酒逐渐下降，V类和VI类基础酒醇类物质含量相对于I类至IV类基础酒略高。第IV类基础酒的酸醇酯总量最低，除第IV类基础酒外，随着基础酒类别的降低其中酸醇酯的总量呈逐步减少趋势。I类至III类基础酒等级越高，其物质组成越丰富；但等级降至第IV类基础酒之后，物质组成的丰富度并未与等级高低呈线性相关。

图1 浓香型白酒不同类别基础酒各类物质总含量

计算各类物质在酸醇酯总量中的占比可知（图2），随基础酒等级降低，酸类物质占比降低，醇类、酯类物质占比增加。结合图3醇类物质的含量热图可知，第V类、第IV类基础酒中杂醇油含量显著增加。杂醇油既是白酒中醇甜和助香的主要物质，又是形成香味物质的前体，但除了正己醇、庚醇和苯乙醇微甜外，其余均呈苦味或涩味，含量过多不仅会使酒的感官呈辣、苦、涩味，影响酒的口感，而且对人体有毒害作用[19]。酸、酯占比降低，杂醇油占比增加影响基础酒口感，导致其评级较低。

图2 浓香型白酒不同类别基础酒各类物质占比

图3 浓香型白酒不同类别基础酒醇类含量

2.2.2 四大酯含量分析

己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯是浓香型白酒中的四大主要酯类物质，四大酯类化合物之间的比例决定着白酒的所属风格。

因此，研究四大酯类物质在6类基础酒中的含量可知（图4(a)），I—IV类基础酒中，己酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯的含量均随着等级降低而降低；第V类和第VI类中三者含量也随等级降低而降低，但均高于第IV类。乳酸乙酯含量随基础酒等级的降低呈现先增后降再增再降的波动式变化。计算各组分占四大酯总量的百分比（图4(b)）发现，随着基础酒等级的降低，己酸乙酯呈降低趋势，乳酸乙酯呈增加趋势，乙酸乙酯和丁酸乙酯变化不显著。

图4 浓香型白酒不同类别基础酒四大酯含量及其占比

综上所述，己酸乙酯和乳酸乙酯在四大酯总量中的比例（y）可作为基础酒等级(x：1，2，3，4，5，6)评定的参考指标，其线性拟合方程如表3所示。

表3 己酸乙酯和乳酸乙酯在四大酯总量中的占比与基础酒等级的线性关系

2.3 各类别基础酒酒样等级与挥发性组分相关性判断

基础酒酒样色谱分析共测得66个组分，结果见表4。对基础酒人工尝评分类和基础酒挥发性组分数据（表4）进行PLS-DA相关性判别分析，筛选出38个变量（VIP＞0.5）分别是：2-丁醇，甲醇，糠醇，正丙醇，正丁醇，丙酸，丁酸，己酸，壬酸，戊酸，辛酸，乙酸，异丁酸，异戊酸，丙酸乙酯，丁二酸二乙酯，丁酸乙酯，庚酸乙酯，己酸乙酯，己酸异戊酯，甲酸乙酯，癸酸乙酯，肉豆蔻酸乙酯，乳酸乙酯，戊酸乙酯，辛酸乙酯，乙酸乙酯，异丁酸乙酯，糠醛，2-丁酮，2-戊酮，3-羟基-2-丁酮，甲基异丁基酮，总酸，总酯，总酮和总醇（不含乙醇）。将6类基础酒与38个变量进行PLS建模，通过PLS回归分析建立的基础酒分级与挥发性组分的相关性模型，分类变量的模型预测值与实测值的相关系数均达到了94.8 %（Comp1+Comp2+Comp3），说明模型的拟合性较好。同样模型对组内数据预测准确率达到98.5 %（Comp1+Comp2+Comp3）（表5），说明模型的建立是合理的并且具有很高的精度。

表4 基础酒酒样主要挥发性物质(醇类)色谱分析结果 (mg/L)

续表4(一) 基础酒酒样主要挥发性物质(酸类)色谱分析结果 (mg/L)

续表4(二) 基础酒酒样主要挥发性物质(酯类)色谱分析结果 (mg/L)

由PLS-DA判别结果可以看到，向量（comp1/comp2）可以解释基础酒定级与挥发性组分的相关性为89.5%。其中总酸、总酯和除乳酸乙酯以外的其余乙酯类化合物对基础酒定级呈正相关性。而乳酸乙酯，总酮，醇类中杂醇油总含量和糠醛等对酒的质量呈负相关性。丁酸、戊酸、辛酸等酸类物质对基础酒中的II、III、IV 3类有较大影响。通过该方法可以有效的把不同类别基础酒区分为I类，IIIIIIV类，VVI类3个聚类。

续表4(三) 基础酒酒样主要挥发性物质(醛酮类)色谱分析结果 (mg/L)

续表4(四) 基础酒酒样主要挥发性物质(烷烃、呋喃类)色谱分析结果 (mg/L)

表5 PLS模型拟合效果参数

图5 1向量、2向量（comp1/comp2）上不同级别基础酒与变量的PLS分析

3 结论

通过对浓香型白酒6种不同类别的基础酒中的挥发性化合物进行检测，其酒精度在60 %vol～68 %vol范围内，酸类、酯类、醇类物质总含量分别为0.8～1.5 g/L、4～12 g/L和0.15～0.5 g/L。随着基础酒等级降低，酒精度、总酸、总酯含量均呈现下降趋势，其中第IV类基础酒酸类物质略有回升、而酯类物质骤降。I类至III类基础酒等级越高，其物质组成越丰富。酸、酯占比降低，杂醇油占比增加影响基础酒口感，导致其评级较低。其中，四大酯含量与基础酒等级存在较大相关性，己酸乙酯和乳酸乙酯在四大酯总量中的比例可作为基础酒等级评定的参考指标，两者的线性方程拟合度好，R2分别为0.9374和0.9905。

图6 1向量、3向量（comp1/comp3）上不同级别基础酒与变量的PLS分析

PLS-DA判别和PLS回归分析方法应用于基础酒等级评定具有良好的模型拟合度（R2=94.8%）和预测精确度（准确率=98.5%），筛选出38个与基础酒等级相关性较高的成分。此方法便于采集基础酒指纹图谱，且能够聚焦关键化合物，所采用的多元统计分析方法便于推广，对于其他白酒产品等级分类具有较好的借鉴意义。