不同百合样品中13 种内源性游离糖的含量分析

孔 滢，王 欢，郎利新，窦晓莹，白锦荣,*

（1.北京市辐射中心，北京 100875；2.北京市科学技术研究院，北京 100089；3.北京师范大学核科学与技术学院，射线束技术教育部重点实验室，北京 100875）

百合是百合科（Liliaceae）百合属（Lilium）植物，地下部分具肉质鳞茎，富含多种营养成分和活性物质，是我国传统的药食两用品种[1-2]。百合用作药用最早记载于《神农本草经》，“味甘，平。主邪气腹张，心痛，利大小便，补中益气”[3]。《中华人民共和国药典》（2015年版）中收录了3 种药用百合，包括卷丹（L.lancifolium）、百合（L.browniivar.viridulum）和细叶百合（又名山丹，L.pumilum），入药部位为干燥肉质鳞片，“味微苦”，有“养阴润肺、清心安神”的功效[4]。食用百合有着悠久的栽培历史，是当前市场上热销的特种蔬菜类型[2,5]，主要为百合（商品名龙牙百合，为区分本实验中使用商品名）、卷丹（商品名宜兴百合、龙山百合等）和兰州百合（L.davidiivar.willmottiae）的鳞茎[6]。不同百合在营养成分含量、品质和风味上存在差异[7]，例如卷丹口感带有苦味，被称为“苦百合”[2]，而兰州百合因口感甜美被称为“甜百合”[8]。除新鲜鳞茎直接食用外，百合还常被做成百合干和百合粉等[9]，百合干既是中药百合的主要制成品，也是兰州百合的主要加工产品之一[6]。

百合鳞茎中富含糖类物质，不仅有高含量的淀粉，还有内源性游离态的单糖和二糖等。大部分游离态单糖和二糖易溶于水、有不同程度的甜味[10]，和百合的“甜味”品质有关。糖类是生命体的基本组成部分和重要营养物质，也是食品中的重要风味成分和营养成分[11]。此外，糖作为渗透剂和信号分子还参与了植物对环境胁迫的响应与适应[12]，例如阿拉伯糖在耐盐胁迫中发挥着重要作用[13]；海藻糖可以在干旱、寒冷等极端条件下稳定细胞膜和蛋白质的结构，是胁迫保护剂，被称为“生命之糖”[14-15]；糖还作为碳源和代谢底物参与花青苷的生物合成[16]。目前糖含量的测定方法主要有化学法和仪器分析法[17]，化学法可以测定食品中的还原糖和可溶性糖总量，但无法确定糖的种类；用高效液相色谱法检测则需要专用检测器[18]。糖类化合物本身不具有挥发性，其硅醚化衍生物却有着很好的挥发性，能够通过气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用进行定性定量分析，该方法重复性和稳定性好，且具有高分辨率和高灵敏度等优点，已经在枣（Zizyphusjujube）和甘薯（Ipomoeabatatas）等植物中开展了应用[18-20]。

本研究对不同百合样品中的13 种内源性游离态单糖和二糖（以下简称游离糖）的含量进行GC-MS联用检测，分析不同百合样品间糖种类及含量的差异与原因，以期为百合资源评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选择来自不同产地的食用药用百合鲜鳞茎10 份（包括兰州百合、山丹、卷丹和龙牙百合等）、百合干2 份（兰州百合干和龙牙百合干），选择岷江百合（L.regale）鳞茎、亚洲百合‘Tresor’鳞茎和卷丹珠芽为对照。百合鳞茎及珠芽先在冷藏箱中（4 ℃，相对湿度70%）贮藏2～3 周，然后剥取百合鳞茎的中层鳞片，冲洗干净后吸干水分，快速切成1～2 cm的小块，液氮速冻后保存；百合珠芽剥去最外层鳞片后置于液氮中速冻后保存。龙牙百合干购自北京同仁堂药房，兰州百合干购自临洮雪源金正百合有限责任公司。具体信息见表1。

表1 百合样品信息Table 1 Information on lily samples tested in this study

N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（含1%三甲基氯硅烷）（纯度99%）、甲醇、正己烷和异丙醇（均为色谱纯） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲氧胺盐（纯度99%）、吡啶（纯度99%） 美国Sigma公司；标准品D-阿拉伯糖、L-鼠李糖、L-岩藻糖、乳糖和肌醇 上海安谱实验科技股份有限公司；木糖醇、D-果糖、葡萄糖、麦芽糖 上海甄准生物科技有限公司；D-半乳糖、D-山梨醇和海藻糖 梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；蔗糖 北京索莱宝科技有限公司；内标核糖醇 百灵威科技有限公司。

1.2 仪器与设备

MM 400研磨仪 德国Retsch公司；7890B-7000D GC-MS联用仪 安捷伦科技（中国）有限公司；SCIENTZ-50ND真空冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司；5424R离心机 德国Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 样品衍生化

将超低温冷冻样品进行真空冷冻干燥后，用研磨仪研磨（1.5 min，30 Hz）成粉末状。称取20 mg的粉末溶解于500 μL甲醇-异丙醇-水（3∶3∶2，V/V）提取液中，涡旋3 min，冰水中超声30 min；4 ℃、14 000 r/min离心3 min后，吸取50 μL上清液，加入20 μL内标，氮吹并冻干机冻干。加入100 μL甲氧铵盐吡啶（15 mg/mL），37 ℃孵育2 h，随后加入N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺100 μL，37 ℃孵育30 min得到衍生化溶液。用正己烷稀释，保存于棕色进样瓶中用于GC-MS分析。每个样品3 次生物学重复。

1.3.2 GC-MS测定

GC条件：DB-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气氦气，流速1 mL/min；进样口温度250 ℃；进样模式分流，分流比3∶1；程序升温：起始温度70 ℃，保持1 min，然后以5 ℃/min升至112 ℃后保持3 min，以15 ℃/min升至175 ℃后保持1 min，以3 ℃/min升至190 ℃，保持3 min，以15 ℃/min升至240 ℃后保持1 min，再以5 ℃/min升至280 ℃后并保持3 min；传输线温度240 ℃。

MS条件：电子电离源；电子能量70 eV；传输线温度240 ℃；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；选择离子扫描模式。

1.3.3 标准曲线制备与样品定量

配制核糖醇内标，衍生化后稀释成50 μg/mL。标准品为配制13 种糖类标准品的混合液，衍生化后得到150 μg/mL的混合液，稀释成不同梯度进行GC-MS检测。以标准品的质量浓度与内标质量浓度的比值为横坐标，标准品与内标的峰面积比值为纵坐标考察线性。得到的各物质的线性回归方程（表2）。将检测到的所有样本糖类的积分峰面积代入标准曲线方程进行计算，最终得到实际样本中糖类的含量，公式如下：

式中：A为样本中糖类的含量/（mg/g）；B为样本中糖类积分峰面积代入标准曲线得到的质量浓度/（μg/mL）；C为定容所用溶液的体积/μL；E为样品提取过程中加入样本提取液的体积/μL；D为样品提取过程中收集上清液的体积/μL；F为称取的样本质量/g。

甜度值计算参照文献[21-22]的方法并略加修改，以蔗糖甜度值为1.00，葡萄糖为0.70，果糖为1.75（表2）。L-岩藻糖和D-阿拉伯糖甜度值未知，在各个样品中含量较低，做缺失值处理。

表2 糖类标准品的标准曲线方程、相关系数及甜度值Table 2 Calibration equations, correlation coefficients and sweetness of sugar standards

1.4 数据处理

用Excel 2019进行数据整理，用IBM SPSS Statistics 20进行方差分析（P＜0.05）。用Rstudio软件进行数据分析与图片绘制，使用corrplot包进行相关性分析[26]，使用ComplexHeatmap包进行聚类分析和热图绘制[27]，使用factoextra包进行主成分分析（principal component analysis，PCA）。

2 结果与分析

2.1 不同百合的游离糖含量

如表3所示，在15 个百合样品中共检测到13 种游离糖。对游离糖总含量进行比较，结果显示兰州百合和山丹（承德）中的总含量很高（111.772～143.432 mg/g）；山丹（延安）、卷丹、龙牙百合、兰州百合干、岷江百合和卷丹珠芽中的总含量处于中等水平（47.302～83.515 mg/g）。龙牙百合干和‘Tresor’鳞茎的总含量最低（10.250～18.945 mg/g）。具体种类而言，蔗糖在各个样品中的含量均为最高（9.290～135.000 mg/g），除岷江百合外占到游离糖总含量的86%以上，远高于其他糖类。葡萄糖（0.204～17.057 mg/g）和果糖（0.236～5.010 mg/g）的含量也较高；麦芽糖（NA～3.603 mg/g）、肌醇（0.065～1.275 mg/g）和海藻糖（0.035～0.976 mg/g）在一些样品中的含量也较高，其他游离糖的含量处于极低水平。整体而言，所有百合样品中含量最高的3 种游离糖为蔗糖、葡萄糖和果糖（图1）。

表3 不同百合样品中的13 种内源性游离糖含量及甜度值Table 3 Contents of 13 intrinsic free sugars and sweetness in different lily samples

图1 不同内源性游离糖种类在百合样品中的含量Fig.1 Contents of intrinsic free sugars in different lily samples

2.2 卷丹鳞茎和卷丹珠芽的游离糖含量

对不同产地的卷丹鳞茎中的游离糖含量进行比较，发现4 个卷丹鳞茎样品中游离糖种类和含量都很接近。卷丹（阿坝）为野生状态，种球周径最小，大部分游离糖含量都低于其他卷丹样品（表3）。卷丹（宜兴）中的蔗糖∶葡萄糖为52.72∶1，与其他卷丹鳞茎样品差异较大（表3）。卷丹（龙山）中海藻糖含量是其他卷丹鳞茎的2～3 倍，显著高于其他卷丹样品（图1），推测卷丹（龙山）可能有着更高的抗性。

卷丹珠芽中共检测到10 种游离糖，比同产地的卷丹（阿坝）多1 种（乳糖），游离糖总含量是卷丹（阿坝）的1.5 倍，其中蔗糖、果糖和葡萄糖含量分别比卷丹（阿坝）高出48%、160%和168%。同时卷丹珠芽中游离糖总含量也略高于其他卷丹样品（表3）。与其他卷丹样品相比，卷丹珠芽中的果糖、葡萄糖和乳糖含量上有显著优势。卷丹珠芽为紫黑色，是卷丹地上部分主要的淀粉贮藏器官，可入菜或熬汤，含有大量的花青苷[28-29]。有研究发现蔗糖、葡萄糖和果糖能促进萝卜（Raphanus sativus）下胚轴中花青苷和葡萄（Vitisvinifera）果肉花青苷的积累[30-31]，推测卷丹珠芽中的游离糖含量差异可能和花青苷积累有关。

2.3 百合干的游离糖含量

如表3所示，与同种的百合鳞茎相比，兰州百合干和龙牙百合干中的游离糖总含量和3 种主要的游离糖含量有明显降低，总含量分别下降36%和83%、蔗糖含量分别下降了36%和84%、葡萄糖含量分别下降了42%和38%、果糖含量分别下降了51%和63%。但是百合干中的游离糖种类有所增加，兰州百合干同比增加了L-鼠李糖和乳糖，龙牙百合干同比增加了木糖醇，但是含量都比较低。未发现百合干中特有的游离糖物质。

有研究发现中药材泽泻炮制成泽泻饮片后，还原糖果糖和葡萄糖的含量有所下降，推测是由于炮制的热加工过程中造成的[32]。百合干在加工过程中，用100 ℃热水对清洗后的干净鳞片短时间（2 min）烫漂，发生了游离糖的水解导致含量下降[6]。尽管百合鳞片中富含淀粉，由于热加工时间短未发生完全水解，所以百合干中的游离糖含量没有提高。

2.4 不同百合甜度值比较

对百合样品的甜度值计算后发现，百合样品的甜度值与游离糖总含量水平基本一致（表3）。具体而言，山丹（承德）和兰州百合的甜度值最高，亚洲百合‘Tresor’鳞茎和龙牙百合干的甜度值最低，其他百合样品的甜度值为中等水平。蔗糖与甜度值的相关系数非常高（Pearson相关系数为0.99），这是由于蔗糖在百合游离糖中占绝对主导地位，说明蔗糖的含量多少可以体现百合中甜度值的高低（表4）。

“甜百合”兰州百合鳞茎中的蔗糖含量和甜度值较高；“苦百合”卷丹蔗糖含量和甜度值较低，说明甜度值和百合口感正相关。药用的龙牙百合干中的蔗糖含量和甜度值都很低，验证了药典中描述的药用百合鳞片“气微，味微苦”。但是甜度值又不能完全反应百合口感，因为百合作为药食两用植物，含有多种活性成分如酚类物质、皂苷和生物碱等[33]，这些会导致口感发涩发苦。例如兰州百合（兰州）中未检测到甾体皂苷[34]，而3 种药用百合和药用百合干中都含有较高的甾体皂苷含量[35]。有研究认为岷江百合有着较高的营养品质，但其口感苦涩[36]，这可能和岷江百合的紫色鳞茎中有高含量的多酚物质有关[37]。

表4 百合样品中内源性游离糖含量及甜度值的相关性分析Table 4 Correlation analysis between contents of intrinsic free sugars and sweetness in different lily samples

2.5 不同百合间的游离糖含量差异

由于蔗糖含量和其他游离糖的含量差异较大，数据均一化处理后对不同百合样品的游离糖含量进行聚类分析和PCA。如图2所示，聚类分析将本实验的15 个样品被分为6 组：2 种百合干聚为组A；‘Tresor’聚为组B；大部分龙牙百合聚为组C且距离较近，同组中还有岷江百合；绝大部分的卷丹和卷丹珠芽聚为组D；大部分山丹样品聚为组E；兰州百合样品聚为组F。尽管在龙牙百合（万载）、卷丹（漫水河）和山丹（延安）的样品中存在着种内差异，但整体而言，百合鳞茎样品在游离糖组成上是（品）种间差异大于（品）种内差异。

如图3所示，兰州百合、山丹和岷江百合在多种游离糖的含量上较为突出。其中，山丹中除了蔗糖含量较高（80.300～135.000 mg/g），还有最高含量的麦芽糖（1.309～3.603 mg/g）；兰州百合中的蔗糖含量很高（106.333～111.033 mg/g），还有较高含量的葡萄糖（1.870～2.600 mg/g）和果糖（1.394～2.010 mg/g）等；岷江百合中虽然蔗糖含量不高，但有最高含量的果糖（5.010 mg/g）和葡萄糖（17.057 mg/g），显著高于其他百合样品。

图2 不同百合样品中内源性游离糖含量的聚类分析Fig.2 Hierarchical cluster analysis of the contents of intrinsic free sugars in different lily samples

图3 不同百合样品中内源性游离糖含量的PCAFig.3 Principal component analysis of the contents of intrinsic free sugars in different lily samples

不同产地的卷丹差异不大，但不同产地的兰州百合和山丹中有着较大差异。山丹（承德）中的所有游离糖含量都高于山丹（延安），这种差异除了生长环境不同，可能和种球大小有关，山丹（承德）的种球更大，能够积累更多的糖类物质，导致游离糖含量高于山丹（延安）。不同来源的兰州百合种内差异也较大，这可能受到冷藏时间的影响。兰州百合（兰州）为真空包装的鲜百合，冷藏时间未知，而不同时间的低温冷藏对兰州百合的可溶性糖含量影响较大[38]。岷江百合有着紫色鳞茎，富含花青苷，游离糖含量与其他百合的白色鳞茎样品有着明显的差异，推测是由于葡萄糖和果糖等糖类参与了鳞茎中花青苷的合成与积累。

3 结 论

本研究对百合中内源性游离糖的种类和含量进行系统研究，结果显示山丹和兰州百合的鳞茎中蔗糖含量和游离糖总含量较高；卷丹和龙牙百合的鳞茎中蔗糖含量和游离糖总含量较低；岷江百合中的果糖和葡萄糖含量很高。不同产地的山丹和兰州百合中游离糖含量差异较大。山丹、兰州百合和岷江百合在多种游离糖上含量较高，有着很好的开发应用潜力。同时也发现，鳞片中含有花青苷的岷江百合和卷丹珠芽中都有较高的果糖和葡萄糖含量，它们在花青苷合成和积累中的作用有待进一步研究。