利用牡蛎制备DPP-IV抑制肽及其活性分析

陈 宏，章 骞,2，陈玉磊,2，翁 凌,2，张凌晶,2，谢少浩，刘光明,2，曹敏杰,2,*

（1.集美大学食品与生物工程学院，福建 厦门 361021；2.大连工业大学 海洋食品深加工协同创新中心，辽宁 大连 116034）

牡蛎，又称生蚝、蛎黄、海蛎子等，是我国重要的养殖贝类。据统计，2018年我国牡蛎产量达514万 t，占贝类总产量的35.6%，具有很高的经济价值[1]。牡蛎肉营养丰富，富含优质蛋白质、糖原、牛磺酸以及多种微量元素[2]。研究表明，利用牡蛎肉提取生物活性成分，具有抗氧化、抗肿瘤和降血压等活性功能[3-5]。福建牡蛎年产量达190万 t，但目前牡蛎主要以鲜食和传统粗加工为主[6-8]，因此，利用现代食品生物技术实现牡蛎的精深加工和高值化利用，有助于牡蛎资源的高值化开发利用。

胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）和葡萄糖依赖性促胰岛素激素（glucose-dependent insulinotropic polypeptide，GIP）能够促进机体的胰岛素分泌，抑制胰高血糖素的分泌，在人体血糖平衡调节中具有重要作用[9]。研究发现，二肽基肽酶-IV（dipeptidyl peptidase-IV，DPP-IV）可将GLP-1和GIP氨基末端的两个氨基酸切除，使其失去生理功能，影响血糖调节[10]。因此，抑制DPP-IV活性有利于控制血糖水平。目前，以DPP-IV为治疗靶点，已开发出如西格列汀、维达列汀和沙格列汀等多种合成药物，它们对II型糖尿病具有良好的治疗效果，但这些药物往往伴随着一定的副作用[11]。据报道，食源性的DPP-IV抑制肽具有易吸收、安全性高等优点，近年来在II型糖尿病的预防方面备受关注[12]。目前，已有许多国内外学者从不同来源的蛋白质中获得DPP-IV抑制肽[13]。牡蛎富含优质蛋白质，是制备功能活性肽的理想原料，此外，牡蛎还含有丰富的锌元素[2]，而锌元素具有调节胰岛素合成、分泌和葡萄糖转运等作用[14]。因此，利用牡蛎制备降血糖功能性食品更具有优势。

本研究以长牡蛎（Crassostrea gigas）为原料，以DPP-IV抑制率为指标，利用商品酶酶解牡蛎肉制备酶解液，分析其对DPP-IV的抑制效果。进一步对活性组分进行分离纯化和肽氨基酸组成鉴定，并对其进行合成验证，以期为牡蛎的功能性食品开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜长牡蛎购于厦门市夏商国际水产交易中心。

商品酶（木瓜蛋白酶（100 000 U/g）、碱性蛋白酶（200 000 U/g）、胰酶（4 000 U/g）、中性蛋白酶（400 000 U/g）） 广西南宁庞博生物工程有限公司；复合蛋白酶（1.5 AU/g） 诺维信生物技术有限公司；DPP-IV 美国Sigma-Aldrich公司；Sephadex G-15凝胶柱美国GE Healthcare公司；荧光底物甘氨酰-脯氨酸-MCA（Gly-Pro-MCA） 日本Peptide Institute公司；乙腈（色谱纯） 美国Tedia公司；合成肽HDGKGLFYNSYPD QEGKSDGTETSTNLHQKLYYHVLGTPQSEDVLCAE FP、APSTM和ILAPPER 合肥塞曼诺生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

PT-2100组织捣碎机 瑞士Kinematica公司；5417R小型高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；Infinite®M200 PRO酶标仪 瑞士Tecan公司；GF-1260高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪美国Agilent公司；Triple TOF 6600质谱仪 美国AB SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 酶解条件优化

1.3.1.1 商品酶的筛选

牡蛎肉与20 mmol/L缓冲液按料液比1∶2（g/mL）捣碎，选取5 种商品酶（木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、胰酶、中性蛋白酶和复合蛋白酶）在各自最适的pH值（相应的缓冲液）和温度下，加酶量为牡蛎肉质量的0.5%，酶解时间为150 min，制备得到酶解液，分别测定酶解液对DPP-IV的抑制活性，筛选最适的商品酶[15]。

1.3.1.2 加酶量的确定

选取对DPP-IV抑制效果最好的蛋白酶，在其最适反应温度和pH值条件下优化加酶量。在加酶量分别为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%条件下酶解牡蛎肉，测定酶解液对DPP-IV的抑制活性。

1.3.1.3 酶解时间的确定

在最适反应温度和pH值条件下优化牡蛎肉酶解时间。在酶解时间分别为30、60、90、120 min和150 min时，测定酶解液对DPP-IV的抑制活性。

1.3.2 DPP-IV抑制活性测定

参照Sato等[16]的方法并略作修改，依次将pH 8.0、20 mmol/L Tris-HCl缓冲液（50 μL）、DPP-IV（10 μL）、抑制剂（10 μL）加入到黑色酶标板混匀，在37 ℃孵育5 min，加入10 μmol/L荧光底物Gly-Pro-MCA溶液（30 μL）启动反应，继续在37 ℃条件下孵育30 min，利用酶标仪测定其荧光强度（激发波长380 nm，发射波长450 nm）。DPP-IV抑制率计算如下式所示：

式中：F对照为对照组的荧光强度；F样品为实验组的荧光强度。

1.3.3 分子质量分布测定

参考Wu Qiang等[17]的方法。色谱条件：GF-1260 Agilent HPLC纯化系统；色谱柱为TSK G2000 SWXL（300 mm×7.8 mm）；流动相乙腈-水-三氟乙酸（45∶55∶0.1，V/V）；检测波长220 nm；进样量10 μL；流速0.5 mL/min；柱温25 ℃。用标准品分子质量的对数值和保留时间绘制得到标准曲线及方程。不同分子质量的标准溶液：鱼小清蛋白II，11 950 Da；50肽，5 617.97 Da；杆菌肽，1 422.69 Da；Gly-Gly-Arg-Tyr，451.48 Da；Tyr，181.19 Da。

1.3.4 超滤

称取牡蛎肉，按牡蛎肉-缓冲液（pH 8.0）1∶2（g/mL）捣碎均匀，根据单因素试验优化的酶解条件为：胰酶加酶量0.8%、pH 8.0、温度37 ℃、酶解90 min，结束后用100 ℃沸水浴中灭酶10 min，10 000×g离心10 min，取上清液。将上清液用3 kDa超滤膜超滤，分别收集内、外液，冷冻干燥，测定其对DPP-IV的抑制活性。

1.3.5 Sephadex G-15分离

将冷冻干燥的组分用超纯水复溶，用0.22 μm滤膜过滤后。将滤出液上样于超纯水平衡好的Sephadex G-15凝胶柱（1.5 cm×100 cm），测定各组分中多肽的浓度以及各组分对DPP-IV的IC50值，重复多次收集IC50值低的组分，冷冻干燥备用。

1.3.6 反相高效液相色谱（reverse phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）分离

将Sephadex G-15凝胶柱分离得到的IC50最低组分进一步用RP-HPLC分离。纯化条件：GF-1260 Agilent HPLC纯化系统；色谱柱：ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm）；流动相A：含0.1%三氟乙酸的超纯水，流动相B：含0.1%三氟乙酸的乙腈，洗脱条件：0～2 min，100% A，0% B；2～15 min，100%～75% A，0%～25% B；15～25 min，75%～50% A，25%～50% B；检测波长220 nm；进样体积20 μL；流速0.5 mL/min；柱温25 ℃。按出峰时间重复多次收集各组分，测定各组分对DPP-IV抑制活性，选取对DPP-IV抑制活性高的组分用质谱鉴定其氨基酸序列。

1.3.7 质谱鉴定

参照Zhang Jing等[18]的方法。将纯化得到的多肽组分重新溶解于Nano-LC流动相A（0.1%甲酸，2%乙腈）中，进行在线液相色谱-串联质谱分析。样品先经过脱盐保留后再经分析柱（C18反相色谱柱（75 μm×15 cm，3 μm，120 Å）Chrom XP Eksigent）分离，洗脱梯度：0～30 min，8%～38%流动相B（0.1%甲酸，95%乙腈）。

1.3.8 DPP-IV抑制肽的合成

纯度为95%以上的两种肽段Ala-Pro-Ser-Thr-Met（APSTM）和Ile-Leu-Ala-Pro-Pro-Glu-Arg（ILAPPER）委托合肥塞曼诺生物科技有限公司进行合成。

1.3.9 合成肽的DPP-IV抑制活性验证

为了验证合成肽对DPP-IV的抑制活性，取不同浓度的合成肽，参照1.3.2节方法，以抑制肽浓度对数值为横坐标，DPP-IV抑制率为纵坐标，经回归分析，计算得出合成肽对DPP-IV的半抑制浓度（IC50）[19]。

1.3.10 分子对接

DPP-IV（1WCY）的三维结构从PDB（Protein Data Bank）获取，抑制肽结构式利用ChemDraw 17.0软件构建，并优化其结构。利用AutoDock 4.2.6，将两个肽段分别与DPP-IV进行对接，并利用Discovery Studio 4.5分析对接结果。

1.4 数据分析

2 结果与分析

2.1 商品酶的筛选

将牡蛎肉分别用木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、胰酶、中性蛋白酶和复合蛋白酶最适pH值对应的20 mmol/L缓冲液进行酶解，制备酶解液。5 种蛋白酶酶解条件及其产物的DPP-IV抑制率如表1所示。由表1可知，胰酶酶解制备的酶解液对DPP-IV的抑制率最高，达到73%，碱性蛋白酶、中性蛋白酶和复合蛋白酶制备的酶解液对DPP-IV的抑制率相当（63%～64%），木瓜蛋白酶酶解产物抑制效果最差（47%）。因此，后续实验用胰酶作为工具酶开展研究。

表15 种蛋白酶酶解条件及酶解产物的DPP-IV抑制率Table 1 Conditions for enzymatic hydrolysis of oyster with five proteases and DPP-IV inhibitory rates of the resulting hydrolysates

2.2 酶解液分子质量分布

在pH 8.0、温度37 ℃条件下，优化胰酶的加酶量和酶解时间进行牡蛎酶解液的制备，测定不同加酶量和酶解时间下酶解液的分子质量分布。由图1A可知，在酶解150 min的条件下，随着胰酶加酶量增加，分子质量＞500 Da的各个组分所占比例微弱减少，分子质量＜500 Da的组分所占比例相应增加。可能是由于酶解时间较长，分子质量分布比例变化不明显。由图1B可知，在加酶量为0.8%的条件下，随着酶解时间的延长，大量蛋白质底物逐渐被胰酶降解，分子质量＞500 Da的组分占比从酶解30 min的34%下降到酶解150 min的15%，相应地，分子质量＜500 Da的组分增加到85%。相比于Le Maux等[20]利用猪弹性蛋白酶酶解β-乳球蛋白获得不同水解度的酶解产物，分子质量＜1 kDa的组分占比在70%以下，本研究制备的酶解液小分子质量组分占比更高。

图1 加酶量和酶解时间对酶解液分子质量分布的影响Fig.1 Effects of enzyme dosage and hydrolysis duration on the molecular mass distribution of hydrolysates

2.3 胰酶酶解条件优化

进一步探究不同加酶量和酶解时间制备的酶解液对DPP-IV抑制活性的影响，对胰酶酶解条件进行优化。由图2A可知，随着加酶量增加，DPP-IV抑制率呈先上升后下降的趋势，这可能是由于酶过量时，一部分DPP-IV抑制肽被降解为更短的肽段或者氨基酸而降低或失去抑制活性[5,21]。选择加酶量为0.8%进一步优化酶解时间。由图2B可知，随着酶解时间延长，DPP-IV抑制率先上升后逐渐趋于平稳，推测是在酶解前期，牡蛎蛋白被胰酶降解，产生较多的DPP-IV抑制肽，尽管在90 min后仍有分子质量低于500 Da的小肽产生（图1B），由于底物中高分子质量组分的减少，反应趋于平缓。综上，最终确定胰酶酶解条件为加酶量0.8%、酶解时间90 min。

图 2加酶量和酶解时间对DPP-IV抑制率的影响Fig.2 Effects of enzyme dosage and hydrolysis duration on DPP-IV inhibitory rates of hydrolysates

2.4 超滤

牡蛎蛋白酶解液经3 kDa超滤膜超滤，得到分子质量＜3 kDa和＞3 kDa的两个组分，分别测定两个组分的IC50，由图3可知，＜3 kDa组分的IC50值为1.41 mg/mL，显著低于＞3 kDa组分的IC50值（56.89 mg/mL），两者相差40.3 倍。主要原因是＞3 kDa组分是未被充分酶解的大分子多肽，不能进入到DPP-IV活性部位，因此，选择＜3 kDa组分进行下一步分离纯化。

图3 超滤组分对DPP-IV的IC50Fig.3 IC50 of ultrafiltration fractions

2.5 Sephadex G-15分离

分子质量＜3 kDa组分经Sephadex G-15凝胶层析分离得到4 个组分，如图4A所示，分别为F1、F2、F3和F4。将其分别冻干后，测定各组分的IC50值，结果如图4B所示，F2和F3组分的IC50值相当，分别为0.31 mg/mL和0.28 mg/mL，而F1和F4组分的IC50值均大于6 mg/mL。其中，F1组分可能是分子质量较大的多肽，F4组分主要以氨基酸为主，因而其IC50值较高。综上，选择F3组分进一步分离纯化。

图4 Sephadex G-15凝胶柱层析图谱（A）及各组分对DPP-IV的IC50值（B）Fig.4 Sephadex G-15 gel chromatogram (A) and IC50 of all separated fractions (B)

2.6 RP-HPLC分离

F3组分继续利用RP-HPLC分离，结果如图5A所示。按分离度选取5 个组分F3-1、F3-2、F3-3、F3-4和F3-5，分别重复收集冻干，经复溶后配制成0.5 mg/mL的溶液，测定其对DPP-IV的抑制活性。由图5B可知，F3-4组分对DPP-IV的抑制率为34%，显著高于其他组分。收集F3-4组分用质谱鉴定其肽段序列。

图5 RP-HPLC分离图谱（A）及各组分对DPP-IV的抑制率（B）Fig.5 RP-HPLC chromatogram of fraction F3 (A) and DPP-IV inhibitory rates of its sub-fractions (B)

2.7 质谱鉴定结果

F3-4组分经液相色谱-串联质谱鉴定分析，共得到10 个来源于牡蛎蛋白的肽段，包含6～12 个长度不等的氨基酸残基，从中筛选得到2 种多肽，如图6所示，氨基酸序列分别为Glu-Ile-Thr-Ala-Leu-Ala-Pro-Ser-Thr-Met-Lys（EITALAPSTMK，分子质量1 161.36 Da）和Ile-Leu-Ala-Pro-Pro-Glu-Arg（ILAPPER，分子质量794.94 Da）作进一步研究。

图6 EITALAPSTMK（A）和ILAPPER（B）的质谱图Fig.6 Mass spectra of EITALAPSTMK (A) and ILAPPER (B)

2.8 DPP-IV抑制肽抑制活性验证

图7 合成肽APSTM和ILAPPER对DPP-IV的IC50值Fig.7 IC50 of synthetic DPP-IV inhibitory peptides APSTM and ILAPPER

经质谱鉴定得到2 个具有潜在DPP-IV抑制活性的肽段EITALAPSTMK和ILAPPER。肽段EITALAPSTMK序列较长，通过BIOPEP[22]在线预测模拟胃肠液消化后得到肽段APSTM。合成肽APSTM和ILAPPER，分子质量分别为505.59 Da和794.94 Da。进一步测定合成肽对DPP-IV的抑制活性，如图7所示，2 种合成肽APSTM和ILAPPER的IC50值分别为354.81 μmol/L和16.98 μmol/L，其中，七肽ILAPPER的IC50值（16.98 μmol/L）接近于阳性对照抑制肽Ile-Pro-Ile（Diprotin A）的IC50值（12.45 μmol/L）。APSTM的IC50值高于ILAPPER，可能是由于其N-端第2个氨基酸为Pro的肽段容易被DPP-IV降解有关[23]。此外，APSTM的IC50高于Liu Rui等[24]报道的肽段LAPSTM（140.82 μmol/L），可能是由于LAPSTM的N-末端的疏水性氨基酸残基（Leu、Ala和Pro）较多，增强了与DPP-IV活性部位结合的特异性[25]。

2.9 分子对接

图8 APSTM和ILAPPER与DPP-IV的分子对接Fig.8 Molecular docking of APSTM and ILAPPER with DPP-IV

分子对接广泛应用于研究配体与受体之间的相互作用，继而揭示它们的结合位点和结合模式[26]。DPP-IV的催化三连体为Ser630、Asp708和His740[27]，活性部位包含疏水口袋S1（Tyr631、Val656、Trp659、Tyr662、Tyr666和Val711）和电荷口袋S2（Arg125、Glu205、Glu206、Phe357、Ser209和Arg358）组成[28]。如图8所示，APSTM中Ala的氨基有两个氢原子与DPP-IV的S1口袋Tyr662和S2口袋Glu205、Glu206形成3 个氢键，且Tyr662与Pro的吡咯环形成氢键，与Ser630、Tyr666等氨基酸残基形成的范德华力主要集中在APSTM的N-末端，与Trp629、His740形成π键。ILAPPER和DPP-IV的氢键作用力体现在：催化中心Ser630、His740与Arg的羧基，S2口袋的Glu205、Glu206与Ile的氨基氢原子，Arg125与Glu的羧基，以及Tyr547与Arg的羧基形成氢键，与活性位点的Tyr631、Ser209所形成的范德华力集中在ILAPPER的N-末端，与Arg125、His126、Phe357、Trp629和Tyr666形成π键。据文献报道，DPP-IV抑制肽主要与其催化中心、S1和S2口袋等关键氨基酸形成相互作用力[29-31]。结合两个肽段对DPP-IV的抑制活性，尽管它们均与DPP-IV的关键氨基酸Arg125、Glu205、Glu206形成氢键，以及范德华力均集中在N-末端，但ILAPPER与DPP-IV的催化中心Ser630形成作用力更强的氢键，且形成更多的π键。因此，ILAPPER对DPP-IV具有更好的抑制效果。

3 结 论

牡蛎含有丰富的蛋白质，利用胰酶酶解可制备对DPP-IV具有抑制作用的产物。优化酶解条件为胰酶加酶量0.8%、pH 8.0、温度37 ℃、酶解时间90 min。酶解液经超滤、Sephadex G-15和RP-HPLC分离纯化得到最终组分F3-4，质谱鉴定出2 种多肽的氨基酸序列EITALAPSTMK和ILAPPER，在线模拟胃肠液消化后，合成了APSTM和ILAPPER两个肽段。结果显示，两个肽段对DPP-IV的IC50值分别为354.81 μmol/L和16.98 μmol/L。通过分子对接模拟，2 个抑制肽主要与DPP-IV活性部位以氢键、范德华力和π键相互作用，而ILAPPER与DPP-IV的催化中心Ser630形成作用力更强的氢键并且形成更多的π键，因此ILAPPER的抑制效果较好。本研究分离纯化的牡蛎肽具有DPP-IV抑制活性，为牡蛎肉的精深加工和高值化利用提供了理论依据。