分段发酵模式对郫县豆瓣甜瓣子发酵过程中微生物及产品品质的影响

李雄波，邓维琴，李 恒,2，范智义，李洁芝,2，陈 功,2,*

（1.四川省食品发酵工业研究设计院有限公司，四川 成都 611130；2.四川东坡中国泡菜产业技术研究院，四川 眉山 620030）

郫县豆瓣是以蚕豆、辣椒、面粉和食盐等为原料酿制而成的传统调味品，其生产工艺包括3 个重要发酵阶段：红辣椒→辣椒胚发酵阶段、蚕豆→甜瓣子发酵阶段和辣椒胚-甜瓣子混合发酵阶段[1]。其中，蚕豆→甜瓣子发酵阶段又可分为制曲和甜瓣子发酵两个重要工序，制曲是指蚕豆瓣经漂烫处理后与面粉、曲精混合发酵制得豆瓣曲的过程[2]，甜瓣子发酵则是指豆瓣曲与一定比例盐水混合后发酵得到成熟甜瓣子的过程[3]。甜瓣子作为郫县豆瓣重要的物质成分之一，传统酿造工艺以自然发酵为主，该方式发酵周期一般在6 个月以上，有的甚至超过1 a。因此，部分企业为缩短发酵时间，采用高温（30～40 ℃）发酵，但高温条件下优势微生物迅速增殖，而其他微生物生长弱势，加之发酵时间较短，导致高温发酵甜瓣子风味不如自然发酵甜瓣子风味醇厚[4]。

温度是影响发酵进程和产品品质的重要因素。日本高盐稀态发酵酱油普遍采用低温发酵工艺，即先10～15 ℃发酵15～30 d，然后温度上升至25～30 ℃继续发酵3～12 个月[5]。张海珍[6]研究发现日式低温型高盐稀态发酵工艺所酿酱油产品品质好，尤其是风味化合物种类和含量较高，但发酵周期较长。张灵[7]研究发现采用先低温后高温发酵的豆瓣酱，其营养物质和理化指标均优于先高温后低温发酵豆瓣酱，且先低温后高温发酵模式能有效缩短发酵时间。这主要是由于豆瓣酱在先低温后高温发酵过程中细菌菌群组成更丰富[8]。此外，食盐含量也是影响发酵的重要因素之一。食盐含量过高会抑制酶活性及酵母菌、乳酸菌等有益微生物的生长，延长发酵周期；食盐含量过低则对杂菌抑制作用弱，导致腐败菌滋生[9]。Su等[10]认为NaCl对蛋白酶活性有很强的抑制作用，当NaCl从5%提高到14%，蛋白酶活性下降73%。本项目组前期研究结果表明，甜瓣子中食盐含量越低，发酵速度越快，但低盐甜瓣子（食盐质量分数为6%和9%）存在总酸含量过高、产品品质较差等弊端[3]。

本研究在借鉴日式低温型酱油发酵工艺基础上，结合项目组前期研究成果，合理调整甜瓣子发酵过程中温度和食盐含量，建立2 种“先低盐后高盐、先低温后高温”的分段发酵模式，并比较发酵特性，以期为企业改善甜瓣子品质提供一定理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蚕豆、食盐、面粉 市售；曲精（米曲霉3.042）济宁玉园生物有限公司；平板计数琼脂、孟加拉红培养基（生化试剂） 北京奥博星生物技术有限责任公司；氢氧化钠、碳酸氢钠、邻苯二甲酸氢钾、37%甲醛溶液、盐酸（均为分析纯） 成都市科隆化学品有限公司；组胺、腐胺、酪胺、尸胺、色胺、苯乙胺、精胺、亚精胺、乙腈、脯氨酸（均为色谱纯）美国Sigma-Aldrich公司；丹磺酰氯（色谱纯） 美国霍尼韦尔公司；正己烷、甲醇、丙酮（均为色谱纯） 德国Merck公司；4-甲基-2-戊醇（色谱纯） 阿法埃莎（中国）化学有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

GCMS-QP2010气相色谱-质谱（gas chromatographmass spectrometry，GC-MS）联用仪 日本岛津公司；DB-WAX色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm） 美国安捷伦公司；固相微萃取装置（50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头） 美国Supelco公司；LC-2030高效液相色谱仪日本岛津公司；DZKW-4恒温水浴锅 北京中兴伟业仪器有限公司；PHSJ-4F型pH计 梅特勒型-托利多国际贸易（上海）有限公司；SW-CJ-2F超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；LDZF-75L-H高压蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂；SPX-150B-4生化培养箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.3 方法

1.3.1 制曲

参考陈廷廷等[2]方法进行，并稍作调整。将蚕豆瓣放入沸水中漂烫3 min后立即捞出，用冷水冷却到室温，沥干水分后与17%面粉和0.003%曲精混匀（均以干蚕豆瓣计），平铺于簸箕内，盖上棉布，放入30 ℃曲房中制曲48 h，12 h翻曲一次，即得豆瓣曲。

1.3.2 甜瓣子发酵

每组称取2.5 kg豆瓣曲和2.5 kg盐水混匀制得酱醅，通过调节食盐添加量控制酱醅中的食盐含量，酱醅装入玻璃缸中后转移至培养箱进行发酵。分段发酵模式1：前期食盐质量分数为6%，12 ℃发酵12 d；中期食盐质量分数为6%，37 ℃发酵4 d；后期食盐质量分数为15%，37 ℃发酵14 d。分段发酵模式2：前期和中期食盐质量分数为9%，其余条件与模式1相同。对照组采用传统高温发酵工艺，即在食盐质量分数为15%条件下，37 ℃发酵30 d。定期对甜瓣子进行搅动养护，并取样以供检测分析使用。其中，模式1和模式2前期低温低盐发酵，主要是为了抑制各类微生物的生长，保证蛋白酶等酶类充分水解底物，为后续微生物进一步发酵奠定基础；中期高温低盐发酵，促进有益酵母菌和乳酸菌的生长代谢[11]，使得氨基酸态氮及其他风味物质含量迅速提升；后期高温高盐发酵，高盐条件抑制杂菌的生长，高温条件促进甜瓣子后熟。

1.3.3 理化指标的测定

总酸含量的测定：根据GB 5009.235—2016《食品中氨基酸态氮的测定》中酸度计法。

氨基酸态氮含量的测定：根据GB 5009.235—2016《食品中氨基酸态氮的测定》中酸度计法。

1.3.4 微生物总数的测定

细菌总数的测定：根据GB 4789.2—2016《食品微生物学检验 菌落总数测定》中方法稍作调整，对甜瓣子中细菌总数计数用含有0.003%纳他霉素的平板计数培养基倾注培养。

霉菌总数的测定：根据GB 4789.15—2016《食品微生物学检验 霉菌和酵母菌计数》中平板计数法进行计数。

1.3.5 挥发性成分的测定

参照邓维琴等[12]描述的顶空固相微萃取-GC-MS联用技术进行检测，并稍作调整，在样品中加入2 μL 0.5 μg/mL的4-甲基-2-戊醇溶液作为内标物。挥发性化合物的鉴定由NIST11谱库检索结果与人工图谱解析共同确定，化合物含量采用内标进行半定量分析。

1.3.6 生物胺的测定

根据陈功等[13]建立的豆瓣酱中生物胺高效液相色谱法进行测定。

1.3.7 感官评价

选取10 名（男5 名，女5 名）经过一定甜瓣子感官评定训练的人员组成评价小组，评价人员从香气、滋味、色泽、体态4 个方面对甜瓣子进行感官评分，以平均分作为产品指标的评分。感官评定标准见表1。

表1 甜瓣子的感官评分标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of broad bean paste mash

1.4 数据处理

数据采用Excel 2010进行统计分析，采用Origin 2010进行作图。

2 结果与分析

2.1 甜瓣子发酵过程中微生物数量的变化

图1 不同发酵模式下甜瓣子中霉菌总数（A）和细菌总数（B）的变化Fig.1 Changes in mold count (A) and total bacterial count (B) in broad bean paste mash in different fermentation modes

米曲霉被普遍认为是豆酱、面酱、郫县豆瓣以及韩国大酱等发酵食品中的优势微生物[4]。如图1A所示，发酵起始时甜瓣子中霉菌总数在6.90（lg（CFU/g））左右。对照组中霉菌总数在整个发酵过程都呈逐渐下降的趋势，发酵结束时霉菌总数为6.15（lg（CFU/g）），这与黄豆酱中霉菌变化规律一致[14]。分段发酵模式1和模式2中霉菌总数先稳定在6.89～7.12（lg（CFU/g））之间，之后快速下降，这主要是由于发酵中期温度升高，微生物代谢活跃，有机酸、CO2等代谢产物不断积累，造成发酵体系中酸度增加，含氧量下降，使得霉菌开始快速消亡，这在其他酱类产品中也常有报道[14-15]。此外，后期食盐含量提高，高盐环境不利于霉菌的生长[16]，进一步加速了霉菌的消亡。模式1和模式2中霉菌开始快速消亡的时间分别在12 d和16 d，这种差异是由于模式2发酵前中期食盐含量相对较高，其发酵速度不及模式1，有害代谢产物积累速度较慢所致。

传统发酵食品的发酵速度和产品品质与细菌的数量、菌群等密切相关[17]。如图1B所示，起始发酵时甜瓣子中细菌总数较高，在7.27～7.36（lg（CFU/g））之间。对照组中细菌总数呈先下降后缓慢上升至趋于平稳的变化趋势，发酵结束时细菌总数为7.10（lg（CFU/g）），和本项目组前期研究结果一致[3]，其主要原因是发酵过程中不耐受高温高盐条件的细菌逐渐消亡，而耐受性较强的细菌逐渐成为优势菌群。2 种分段发酵模式中细菌总数变化情况相似，发酵前中期（0～16 d）细菌总数在7.25～7.36（lg（CFU/g））之间小范围波动，发酵后期（16～30 d）细菌总数逐渐下降，发酵结束时分别为7.08（lg（CFU/g））和6.98（lg（CFU/g））。模式1和模式2前期发酵体系处于低温环境，微生物生长代谢活动较弱，细菌数量波动较小；发酵中期温度升高，有利于乳酸菌和酵母菌等微生物的代谢[11]，但乳酸菌和酵母菌的代谢产物又抑制了部分菌株的生长[18-19]，因此细菌数量整体趋于稳定；发酵后期，由于食盐含量升高，不耐盐的菌株生长被抑制，因此细菌总数呈现下降趋势。

2.2 甜瓣子发酵过程中理化指标的变化

总酸是衡量甜瓣子品质的重要理化及卫生指标，郫县豆瓣酱中限量为2.0%[20]。同时，甜瓣子中总酸主要由各种有机酸组成，是重要的滋味物质和多种风味物质的前体物质。如图2A所示，对照组中总酸含量在发酵前期（0～12 d）快速上升，中后期（12～30 d）则逐渐趋于稳定，发酵结束时总酸质量分数为0.87%，与刘永琪[21]研究豆瓣酱中总酸变化情况一致。分段发酵模式1和模式2中，总酸含量在发酵前期（0～12 d）变化趋势与对照组一致，但两者总酸含量始终略低于对照组，这是由发酵温度和食盐含量的差异导致。3 种发酵模式前期，甜瓣子中总酸含量均快速上升，这是由于发酵初期体系中蛋白酶、淀粉酶等各类酶系含量丰富，使得淀粉、蛋白质等大分子物质快速水解形成单糖、氨基酸等小分子物质，而乳酸菌、酵母菌等微生物能快速利用这些小分子物质产生有机酸等酸性物质[22-23]。发酵中后期（12～30 d），模式1和模式2中总酸含量变化情况与对照组显著不同，两者总酸含量先快速上升后逐渐趋于平稳，发酵结束时总酸质量分数分别为0.96%和0.92%。有研究表明，低盐甜瓣子（食盐质量分数为6%和9%）发酵过程中总酸质量分数远超过限量值2.0%，产品有明显酸味，品质较差[3]。本研究模式1和模式2中总酸质量分数低于限量值2.0%，符合产品品质要求，且模式1和模式2中总酸质量分数明显高于对照组，这可为甜瓣子中酯类化合物形成提供物质基础，使其风味更加浓郁。

图2 不同发酵模式下甜瓣子中总酸（A）和氨基酸态氮（B）质量分数的变化Fig.2 Changes in total acid (A) and amino acid nitrogen (B) contents of broad bean paste mash in different fermentation modes

甜瓣子中氨基酸态氮主要来自蛋白酶分解原料中蛋白质形成，其是重要的风味物质，与甜瓣子的色、香、味等密切相关，是衡量甜瓣子品质和发酵程度的最主要指标。如图2B所示，对照组甜瓣子中氨基酸态氮质量分数在发酵前期（0～12 d）快速增加，由0.17%增加至0.65%，之后随着发酵的进行氨基酸态氮含量几乎稳定，与刘永琪[21]研究结果一致。这主要是由于制曲阶段以米曲霉为代表的微生物大量繁殖产生蛋白酶[24]，因此发酵初期蛋白酶活性相对较高，分解蛋白质产氨基酸能力较强，但是随着发酵的进行，高温高盐条件使得蛋白酶逐渐失活，因此氨基酸态氮质量分数未能进一步增加。模式1和模式2中氨基酸态氮含量变化情况在发酵前期（0～12 d）与对照组几乎一致，虽然模式1和模式2中盐含量相对更低，但发酵温度也更低，低温不是酶作用的最适温度[25]，因此3 种发酵模式初期蛋白酶水解反应速率差异不大。然而，模式1和模式2中氨基酸态氮含量在发酵中期（12～16 d）快速上升，这是由于低温条件可以长时间保留酶的活性[26]，当发酵中期温度升高时，酶促反应速率显著提高。发酵后期（16～30 d），模式1和模式2中氨基酸态氮含量呈缓慢下降或保持稳定的趋势，这主要是由于蛋白酶失活和美拉德反应消耗氨基酸所导致[21]。发酵结束时，模式1、模式2和对照组中氨基酸态氮质量分数分别为0.76%、0.83%、0.66%，其中模式1和模式2中氨基酸态氮含量高于对照组，在一定程度上更有利于甜瓣子风味及色泽的形成。

2.3 生物胺含量分析

生物胺是一类具有生物活性的脂肪族、芳香族或杂环结构的含氮低分子质量有机化合物[26]，在人体生长发育过程中发挥着重要作用[27]，但过量摄入可能会引发中毒等健康问题[28]。根据实际情况，部分学者建议食品中生物胺总量应不超过1 000 mg/kg[28]。本项目组前期研究发现，低盐甜瓣子发酵过程中生物胺含量超过限量，这主要是由于甜瓣子发酵过程中微生物菌群高度复杂多样，潜在产胺微生物众多，加之低盐条件对微生物抑制作用较弱，因此容易导致生物胺污染。

图3 不同发酵模式甜瓣子中生物胺含量Fig.3 Contents of biogenic amines in broad bean paste mash in different fermentation modes

图3 为发酵结束时甜瓣子中生物胺含量情况，模式1、模式2和对照组甜瓣子中生物胺总量分别为122.93、126.50、176.12 mg/kg，三者均未超过1 000 mg/kg。Chun等[16]研究发现，韩国大酱中食盐含量越低，生物胺含量越高。模式1和模式2发酵前期和中期均处于低盐环境，但生物胺总量却低于对照组，说明分段发酵可以保障产品中生物胺含量在安全范围内。有研究表明，发酵温度越接近微生物生长代谢的最适温度，越有利于微生物代谢形成生物胺[29]。分段发酵过程中，甜瓣子长时间处于低温环境，不利于微生物分泌生物胺，而对照组整个发酵过程都处于37 ℃环境中，从而导致微生物代谢形成生物胺较旺盛。对照组甜瓣子中8 种生物胺均被检出，其中主要的生物胺为腐胺、尸胺、组胺、酪胺及亚精胺，含量分别为33.89、18.44、37.37、36.80、20.45 mg/kg。曾雪晴等[30]研究郫县豆瓣酱中生物胺时发现，郫县豆瓣酱中生物胺总量范围在86.85～611.83 mg/kg之间，腐胺、尸胺、组胺及酪胺是豆瓣中主要的生物胺，与对照组中结果较为相似。模式1和模式2甜瓣子中生物胺含量及组成相似，模式1发酵甜瓣子中腐胺、尸胺和酪胺为主要的生物胺，含量分别为36.79、13.35、46.06 mg/kg，色胺未检出；模式2发酵甜瓣子中腐胺和酪胺为主要的生物胺，含量分别为32.12、70.24 mg/kg，色胺和组胺未检出。此外，对照组甜瓣子中组胺含量较高（37.37 mg/kg），与部分学者建议食品中组胺限量50～100 mg/kg[28]较为接近，可能存在一定风险；而分段发酵模式1和模式2甜瓣子中组胺含量较低或未检出。总之，与对照组相比，分段发酵（模式1、模式2）甜瓣子中生物胺总含量更低，种类更少。

2.4 挥发性成分分析

甜瓣子中挥发性成分包括酯类、醇类、醛酮类、酚类、酸类和杂环类等化合物[31]。通过GC-MS分析3 种模式发酵甜瓣子中挥发性成分，总离子流图见图4，挥发性成分种类及含量见表2，GC-MS分析结果见表3。

图 4不同发酵模式甜瓣子中挥发性成分GC-MS总离子流图Fig.4 GC-MS total ion current chromatogram of volatile components in broad bean paste mash in different fermentation modes

由图4可知，3 种发酵模式甜瓣子中挥发性成分离子出峰时间较类似，但强度存在较大差异，表明有共同挥发性成分，但含量差异较大。由表2、3可知，3 种发酵模式甜瓣子中检测鉴定出39 种挥发性成分，其中共有成分14 种，包括3-甲基-1-丁醇、2-乙基-1-己醇、芳樟醇、苯乙醇、3-烯丙基-6-甲氧基苯酚、壬醛、苯甲醛、丙酮、乙酸、3-甲基丁酸、2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二异丁酸酯、十六烷酸甲酯、十四烷和二十一烷。结合刘平[32]和李治华[33]等研究结果表明，芳樟醇、苯乙醇、壬醛和苯甲醛等是郫县豆瓣的特征风味物质之一。

表2 不同发酵模式甜瓣子中挥发性成分种类及含量Table 2 Types and contents of volatile components in broad bean paste mash in different fermentation modes

表3 不同发酵模式甜瓣子中挥发性成分GC-MS分析结果Table 3 GC-MS analysis of volatile compounds of broad bean paste mash in different fermentation modes

对照组中共鉴定出20 种挥发性成分，总含量为19.61 ng/g，其中含量较高的化合物主要有3-甲基-1-丁醇、2-乙基-1-己醇、苯乙醇、丙酮、乙酸、2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二异丁酸酯、亚油酸乙酯。董丹等[34]从发酵2 个月甜瓣子中检测出85 种挥发性成分，其中亚油酸乙酯、苯乙醇、乙酸、异戊酸等含量较高，与本研究存在一定异同，可能是发酵时间不同导致。模式1中共鉴定出26 种挥发性成分，总含量为31.85 ng/g，模式2中共鉴定出30 种挥发性成分，总含量为24.60 ng/g，两者主要差异是模式1中酯类化合物种类和含量更丰富，而模式2中醇类化合物含量更高。3 种发酵模式甜瓣子中挥发性成分主要以醇类、醛酮类、酸类和酯类为主；而酚类和烷烃类含量较低，且三者之间差异较小。模式2中醇类化合物含量最高，而模式1中最低，但模式1中苯乙醇含量较高（1.09 ng/g），苯乙醇被认为是酱类产品中主要香气成分之一[32]，其能赋予产品花香和蜂蜜气味等香气[31]。醛酮类化合物属于不稳定的羰基类化合物，能赋予产品一定的花果香[35]，使甜瓣子整体风味更醇厚。模式1和模式2中醛酮类化合物种类丰富，含量较高，而对照组中醛酮类化合物种类和含量都不及模式1和模式2。酸类化合物给甜瓣子带来不愉快的味道，一般只起调和作用[34]，模式1和模式2中酸类化合物含量较高，可能给甜瓣子风味带来不利影响。酯类化合物是甜瓣子中主要的呈香成分，其能赋予甜瓣子特殊的甜香和果香[35]，同时能很好地掩盖甜瓣子中有机酸带来的不愉快气味[36]。模式1、模式2和对照组中分别鉴定出酯类化合物7、5、3 种，含量分别为10.34、2.71、2.71 ng/g，模式1中酯类化合物含量是模式2和对照组的3.8 倍。甜瓣子中酯类主要通过高级脂肪酸和醇酯化反应形成[34]，这也可能是导致模式1中醇类化合物含量较低的原因。模式1甜瓣子中挥发性成分总含量最高，尤其是酯类化合物，而模式2中挥发性成分总含量次之，但化合物种类最多。Chun等[16]研究发现，低盐大酱中挥发性成分含量高、种类多，与微生物生长密切相关。分段发酵（模式1、模式2）过程中，环境因素不断变化，为微生物多样性提供更多可能，复杂的菌群结构有利于多种代谢产物的形成，这些代谢产物再经过后期发酵过程中的各种化学反应产生了较多种类的风味物质。

2.5 感官评定

表4 不同发酵模式甜瓣子的感官评分Table 4 Sensory evaluation scores of broad bean paste mash in different fermentation modes

感官评定是对产品品质最直观地反映，因此对不同模式发酵的甜瓣子产品进行感官评定，结果如表4所示。可以看出，3 种发酵模式下，甜瓣子样品在色泽、香气、滋味和组织形态方面存在一些异同。模式1甜瓣子样品感官评定得分最高（80.61±0.87），其酱酯香较浓郁，味鲜醇厚；模式2甜瓣子样品得分次之（75.7±0.82），其体态和滋味与模式1差异较小，但香气不及模式1甜瓣子浓郁；对照组甜瓣子样品得分最低（62.46±1.11），其酱酯香和鲜味都不及分段发酵（模式1、模式2）甜瓣子，且略带霉味，表明对照组甜瓣子还未完全发酵成熟，延长发酵时间，其感官品质能有所提升。此外，郫县豆瓣要求瓣粒酥脆，但分段发酵（模式1、模式2）的甜瓣子产品质地偏软，在组织形态方面存在一定不足。整体而言，分段发酵的甜瓣子感官品质优于对照组，尤其分段发酵模式1发酵的甜瓣子产品。

3 结 论

以传统高温发酵为对照，研究了2 种分段发酵模式（模式1、模式2）对甜瓣子发酵过程中微生物及产品品质的影响。结果表明，不同发酵模式条件下，发酵过程中微生物数量变化情况存在显著差异，进而导致不同模式发酵的甜瓣子产品品质指标差异。发酵结束时，模式1、模式2和对照组甜瓣子中总酸质量分数分别为0.96%、0.92%、0.87%，氨基酸态氮质量分数分别为0.76%、0.83%、0.66%，三者总酸质量分数均低于限量值2.0%，产品品质符合要求，而分段发酵（模式1、模式2）甜瓣子中氨基酸态氮含量更高，则有助于提升产品品质。此外，分段发酵（模式1、模式2）甜瓣子中挥发性成分种类更多，含量更高，尤其是模式1发酵甜瓣子中挥发性成分含量最高。感官评价结果显示，模式1发酵甜瓣子酱香浓郁，味鲜醇厚，整体感官品质最佳，模式2发酵甜瓣子次之，对照组则最差。3 种模式发酵的甜瓣子中生物胺含量均远低于建议限量1 000 mg/kg，且分段发酵甜瓣子生物胺污染的风险更低。分段发酵模式1和模式2条件下甜瓣子均能正常发酵，产品符合有关标准，与对照组相比，分段发酵能进一步改善产品品质，且模式1优于模式2。因此，本研究推荐的一种理想的分段发酵模式为：前期食盐质量分数为6%，12 ℃发酵12 d；中期食盐质量分数为6%，37 ℃发酵4 d；后期食盐质量分数为15%，37 ℃发酵14 d。