miR-5189-3p在下腔深静脉血栓形成的调控机制的研究

冯涛 李晶 潘金强 郑殿宇 鲁静 耿中利 马震

深静脉血栓形成(deep vein thrombosis DVT)是血管外科的常见周围血管疾病之一[1]。近年来，其发病率有逐年上升的趋势,20%～50%的深静脉血栓病人又在此基础上，发展成血栓后综合征(post-thrombotic syndrome，PTS)[2-4]。新疆地区的下肢深静脉血栓患病率在31.0%左右，远远高于其他国家和地区[5]。根据当地的生活习惯、饮食习惯、遗传因素等进行研究发现，吸烟、年龄、新鲜蔬菜摄入量是当地人群遗传性易栓症的主要影响因素。本次通过研究miR-5189-3p在大鼠体内过表达的干预实验，验证靶基因JAG1所在信号通路Notch中Notch1、Hes1、JAG1的表达情况，进一步验证miR-5189-3p在下肢深静脉血栓形成中的表达调控机制。

材料与方法

一、材料

1.实验动物：SPF级SD大鼠48只，体重180～200 g，于无特殊病原体(specific pathogen free,SPF)条件下饲养。饲养环境为温度 22～26 ℃，相对湿度 50%～60%，人工光照明暗各12 h。动物来源于三峡大学实验动物中心，使用许可证号：SYXK(鄂)2018-0104，动物合格证号：42010200002507。

2.实验试剂：HE染色试剂盒(Solarbio公司，中国)，SYBR Green PCR 试剂盒(Biosystems公司，美国)，逆转录试剂盒(TAKARA公司，日本)，Trizol(Ambion公司，美国)，BCA 蛋白浓度测定试剂盒(bioswamp公司，中国)，BAX Polyclonal Antibody(Bioswamp公司，中国)，Bcl-2 Polyclonal Antibody(Bioswamp公司，中国)。

二、方法

1.动物建模：本次建模以白云城等[6]建立的大鼠下腔静脉狭窄法建立大鼠下腔静脉血栓(DVT)模型。将48只SD大鼠随机分组，分为4组，分别为正常对照组(A组)、下腔静脉血栓模型组(B组)、hsa-miR-5189-3p 模拟物组(C组)和hsa-miR-5189-3p模拟物阴性对照组(D组)，每组12只。hsa-miR-5189-3p 模拟物组SD大鼠尾静脉注射hsa-miR-5189-3p mimics、hsa-miR-5189-3p模拟物阴性对照组SD大鼠尾静脉注射hsa-miR-5189-3p mimics NC，按5 μg/kg剂量，溶于1 ml生理盐水中，正常组和下腔静脉血栓模型组SD大鼠尾静脉注射等量生理盐水，注射后24 h造模。大鼠用2%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉后用剃毛器剃除腹部毛发。大鼠仰卧位，用 75%的酒精消毒腹部皮肤，在腹部正中切开 3～4 cm大小纵行切口，逐层分离肌肉，打开腹腔。打开腹腔后，把肠道推向术野左侧，打开后腹膜，暴露下腔静脉，5-0丝线结扎下腔静脉分支至髂静脉，小心分离伴行之腹主动脉，于左肾静脉下2 mm处穿过一根5-0丝线备用，沿静脉走向放置一根3-0丝线，然后结扎下腔静脉后小心抽出3-0丝线，造成下腔静脉狭窄模型，逐层缝合腹腔肌肉组织及皮肤，大鼠完全苏醒后放回饲养笼继续饲养。造模后24 h，分批处死动物。

2.静脉血栓组织病理学检查：静脉血栓组织用4%多聚甲醛磷酸缓冲液固定组织标本，常规石蜡包埋、切片，经苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE)染色后在光镜下观察组织病理变化。

3.RT-qPCR：通过DNAMAN软件设计JAG1、Notch1、Hes1、GAPDH荧光实时定量PCR引物，并由上海生工有限公司合成。分别加入2 μl 5×PrimeScript Buffer，0.5 μl PrimeScript RT Enzyme Mix I，0.5 μl Oligo(dT)15(15 μM)，0.5 μl Random 6 mers(100 μM)，Total RNA 500 ng，RNase Free dH2O达到10 μl，混匀后短暂离心，在PCR仪上37 ℃温浴15 min，85 ℃加热5 s，稀释至35 μl，得到反转录的cDNA。qPCR反应：Forward primer 10 μM 0.8 μl，0.8 μl Reverse primer 10 μM，2XSYBR Select Master Mix(2×)10 μl，RNase-free water 6.4 μl，cDNA template 2 μl，配制成20 μl体系混合均匀，在仪器上保持95 ℃，1 min，95 ℃，10 s，60 ℃ 34 s，40个循环，94 ℃ 1 min 30 s，60 ℃ 1 min，60 ℃→94 ℃，1.1 ℃/s升温，从而获得qPCR反应结果。

三、统计学方法

结果

1.静脉血栓组织病理变化：将收集在10%中性福尔马林的正常对照、下腔深静脉血栓模型组、hsa-miR-5189-3p模拟物组和hsa-miR-5189-3p模拟物阴性对照组组织进行HE染色，观察组织变化。

静脉血栓组织HE实验结果，见图1(A～D)。A组大鼠下腔静脉内皮细胞的尺寸和形状保持统一、内皮细胞紧凑而齐整、表面光滑，内皮细胞层无病理变化，未观察到染色组织内出现炎性细胞和血栓物质的存在，同时未观察到血液内的血细胞和相关因子存在。B组，术后24 h，血栓充满静脉管腔，血栓内存在大量的红细及少量白细胞，血栓机化不明显，下腔静脉管壁未见明显的粘连，血管内皮细胞无脱落现象，静脉周围看见炎细胞浸润，瓣膜周围可见少量炎性细胞浸润。C组，静脉血栓机化，主要从血栓周边处开始。有核细胞开始大量出现在血栓周边处，致使内皮细胞数量增多、单核细胞数量增多、中性粒细胞数量增多、巨噬细胞数量增多，与下肢深静脉血栓组对比，进行血栓组织中的有核细胞较多，机化程度增加，血栓外周区域有大量的裂隙产生和形成，从而形成管腔样结构，有血流再通的征象，可见少许红细胞的存在。D组，静脉血栓机化，主要从血栓周边处开始。有核细胞开始出现在血栓周边处，致使单核细胞数量增多、中性粒细胞数量增多、巨噬细胞数量增多，与下肢深静脉血栓组对比，进行血栓组织中的有核细胞较多，机化程度增加，血栓外周区域有部分小裂隙产生和形成，从而形成管腔样结构，有血流再通的征象，可见少许红细胞的存在。

A：A组，下腔静脉内皮细胞的尺寸和形状保持统一、紧凑而齐整、表面光滑，内皮细胞层无病理变化；B:B组，血栓充满静脉管腔；C：C组，静脉血栓机化，血栓外周区域有大量的裂隙产生和形成，从而形成管腔样结构，有血流再通的征象；D：D组，静脉血栓机化，血栓外周区域有部分小裂隙产生和形成，从而形成管腔样结构，有血流再通的征象

2.qRT-PCR技术检测SD大鼠下腔静脉组织中基因表达情况：通过miRNA预测靶基因，检测组织样品中JAG1、Hes1、Notch1 四个指标在不同分组组织中的表达差异性，具体结果见表1、图2(A～C)。对A组，B组，C组和D组，分别进行JAG1、Hes1、Nothch1 四个基因表达分析。实验结果显示，JAG1在 C组与B组、C组与D组之间表达有统计学意义(P<0.05)。Hes1在A组和其他各组、C组与B组、C组与D组之间表达差异有统计学意义(P<0.05)。Notch1在C组与B组、C组与D组之间表达差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 JAG1、Notch1、Hes1在A组、B组、C组和D组之间的基因表达差异性

图2 JAG1、Hes 1、Notch1在不同分组之间的基因表达差异性

讨论

近年来，在心血管疾病方面，miRNA对血管生成的作用成为研究重点，已知的miRNA包括miR-126、miR-21、miR-221、miR-222等[7-10]。深静脉血栓的引起因素之一为血管损伤，血管损伤早期表征为血管内皮功能降低或发生障碍。研究发现，miRNA在血管损伤后和修复过程中，主要对血管内皮细胞的增殖、迁移和分化起到作用。例如miR-126可以起到抑制血管内膜细胞病变，促进血管损伤的修复，保证血管内皮的整体完整性，防止血管损伤加重，通过miR-126抑制剂检测，EPCs的迁移增殖能力下降。miR-221可以和靶向基因PAK 1相互作用，从而影响MEK/ERK信号通路，抑制EPCs的增殖[11-12]。

JAG1，又被叫做Jagged1，是Notch受体的四大配体之一，主要在血管内皮细胞中表达，在新生血管的形成发展中起到很重要的作用[13]。有研究表明，JAG1基因敲除后，动物的胚胎血管重塑以及卵黄囊的血管重塑都会出现不同程度的障碍问题，会导致血管内皮细胞无法形成功能性作用的网状环样结构，致使细胞的迁移能力和细胞间的传递功能大幅度下降、新生血管无法正常发育、胚胎较容易出现死胎症状。因此，hsa-miR-5189-3p的靶基因JAG1在下肢深静脉血栓中也应该起到对静脉内皮细胞损伤的修复、新生血管的形成、细胞间的功能性因子传递等作用，避免下肢深静脉血栓的形成。

本次实验通过对hsa-miR-5189-3p的目标基因JAG1的研究发现，JAG1是信号通路Notch里面的一个重要调控因子。Notch信号通路是一条高度保守的信号传导途径，可以控制相关传导因子的表达高低来起到调控的功能。其中Notch 1受体分布较广，其普遍的表达于多种组织，包括心脏组织和血管内皮细胞等。Notch的四个配体Dll 1, Dll 4, Jaggde l和Jagged 2在血管内皮细胞中都有表达，并在血管发育中起重要的作用。相关研究结果显示Notch 1的缺失会造成实验动物的无法形成完整功能的血管，而无法生存。Krebs等[14]实验结果阐明，Notch1受体和Notch4受体之间的相互作用在血管形成过程中起到极大的影响作用。Takeshita等[15]通过建立缺血动物模型实验发现，缺血组织的Notch信号通路基因和蛋白表达量较对照组明显升高，内皮细胞增殖速度明显增加，又通过实验发现病理组织区域内，有大量的新生血管在形成，对病灶区进行修复。说明了该通路信号因子对血管的发生、发展和形成过程起到积极的调控作用。

综上所述，JAG 1、Hes 1、Notch 1基因表达与miR-5190-3p的基因表达呈正相关。Hes 1是Notch信号转导途径中一个重要的下游靶基因，转录的Hes 1 mRNA又可以进一步调控下游分子的蛋白表达。因此，miR-5190-3p基因的过表达，可以作用于JAG 1及Notch 1和Hes 1的基因表达，使得JAG 1、Hes 1、Notch 1基因表达得到增强，Notch信号通路的激活，促进静脉内皮细胞增殖分化，抑制凋亡，进而抑制深静脉血栓形成。