黄芪甲苷通过RNF10-NF-κB途径改善小鼠心梗后心室重构的机制研究*

李 康 鞠洪君 蒲 鹏

急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction，AMI)发生时即伴有心室重构的启动[ 1，2]。心室重构往往表现为部分心肌细胞发生坏死、凋亡、自噬或者肥大增生。期间大量炎症反应、炎性介质释放，神经内分泌系统被激活，继而出现细胞外基质改变[3,4]。其部分本质是强烈的炎症反应[5]。因此，调控炎症反应可能有利于心室重构的防治。本课题组前期研究已经证实环指蛋白10(RNF10)与心血管发育密切相关，参与了平滑肌细胞、心肌细胞的凋亡、炎症及细胞外基质改变[6,7]。而作为一条新证实的信号转导途径，RNF10-NF-κB轴更是调控了大量炎性因子的产生与释放，可能影响心室重构。因此，通过干预RNF10-NF-κB轴可能对心梗后心室重构的防治具有重要价值。

黄芪甲苷(Astragaloside Ⅳ, AS)是中药植物黄芪的主要活性成分[8]。其药理作用广泛，包括抗缺血、抗炎、抗心衰和抗肿瘤等作用[9]。研究证实在压力超负荷诱导的心室重构大鼠模型中，AS显现出一定的抗重构效应[10]。但AS抗心梗后心室重构效应尚不清楚，且多数文献并未阐明其具体信号转导机制。结合文献及预实验，我们推测AS可能通过RNF10-NF-κB轴发挥抗炎效应。因此，本研究拟阐明AS对小鼠急性心肌梗死后心室重构是否有改善作用，并探讨可能的作用机制及相关信号转导途径，旨在为临床药物开发、改良提供理论数据。

1 材料与方法

1.1药品与试剂

AS源自成都瑞芬思生物科技有限公司(批号：rfs84687-452；纯度：95%；200g/袋)。Trizol、cDNA合成试剂盒由Invitrogen公司提供。上海生工生物工程技术服务有限公司为本试验提供所需引物。

1.2实验分组及AMI模型建立

60只雄性C57BL/6小鼠(10周龄，平均体重22-28g)购自山东省实验动物中心[动物许可证号：SYXK(鲁) 2019-0007]。所有小鼠根据饮食不同随机分为4组：对照组(n=15)、模型组(n=15)、AS低剂量组(n=15)、AS高剂量组(n=15)。对照组与模型组小鼠接受标准饲料(AIN76A)饲养；AS低剂量组在标准饲料中添加0.4‰AS(折合小鼠体重：40mg/kg)；AS高剂量组在标准饲料中添加0.8‰AS(折合小鼠体重：80mg/kg)，AS添加剂量参考既往相应文献[11]。所有小鼠按上述相应要求喂养2周后进行如下处理：对照组：仅开胸，不结扎冠状动脉；其余三组依据文献建立AMI模型[12]：开胸+冠状动脉结扎(结扎部位选取左心耳下缘约1.0-1.5mm处)。动物模型成功标准：冠脉结扎以下区域变白，出现节段性运动障碍；结扎后心电图提示持续ST 段抬高或出现宽大畸形的QRS 波。本实验所有建模小鼠全部成功，之后所有小鼠按先前包含要求继续饲养。

1.3小鼠生存状况观察

术后观察所有小鼠存活情况，第1日每 2h观察 1 次，后每日观察2次，共计监测2周。记录建模后小鼠死亡情况，根据解剖明确死亡原因是否为心脏破裂(解剖显微镜下可见破裂口，心脏可见暗红色凝血块包裹或附着)，并计算心脏破裂发生率。

1.4小鼠心脏超声检测

模型建立后2周，采用超声仪(美国惠普 Sonos 5500，15MHz高频线阵探头)经胸检查。采集参数包括：心率(HR)、左心室收缩期前壁厚度(Aws)、舒张期前壁厚度(Awd)、收缩期后壁厚度(Pws)、舒张期后壁厚度(Pwd)、左心室收缩末期内径(LVESD)、舒张末期内径(LVEDD)及左心室短轴缩短率(FS)和左室射血分数(LVEF)。

1.5Real-time PCR检测心室重构相关基因、炎性因子及RNF10-P65关键信号基因的表达

模型建立后第15天所有小鼠均脱臼处死。处死前禁食12h，处死后分离左心室，速冻于液氮后转存于-80℃冰箱，用于后续分子生物学检测。提取心室肌总RNA，测定纯度并定量，逆转录合成cDNA；以GAPDH为内参，半定量逆转录聚合酶链反应检测各炎性因子mRNA水平。引物序列自Genebank中检索，采用Primer Express5.0设计。引物序列见表1。各组反应条件为：93℃预变性3.5min后，94℃变性35s，57℃退火30s，72℃延伸30s，共进行40次循环，最后再71℃延伸10min，4℃冷却终止反应。所有实验样品均重复3次，反应结束后，检测各样本的Ct值(7300 System SDS software软件)，根据Ct值计算出各指标各样本mRNA含量的相对值。PCR反应的特异性通过熔解曲线进行判断。

表1 各引物序列

1.6统计学处理

2 结 果

2.1AS未能降低心脏破裂风险

由表2可知，成模14天后，对照组、模型组、AS低剂量组、AS高剂量心脏破裂率分别为0.00%，13.33%，6.67%，0.00%，组间未见明显差异(χ2=3.86,P>0.05)。其中模型组小鼠死亡分别是术后第5天及第7天死亡，AS低剂量组小鼠死亡为术后第5天。死亡小鼠均经尸检验证为心脏破裂。

表2 各组心脏破裂情况(n，%)

2.2AS减缓心梗后心室重构进展

各组心脏超声检测结果差异均有统计学意义(P<0.05)。相较对照组，模型组小鼠LVEDD、LVESD和HR增加，Awsth、Awdth、Pwsth及Pwdth降低，FS及LVEF减退(q均>15.62，P<0.01)。与模型组比较，AS高/低剂量组小鼠LVEDD、LVESD和HR降低，Awsth、Awdth、Pwsth及Pwdth升高，FS及LVEF增强(q均>4.50，P<0.05或P<0.01)，其中AS高剂量组在Awsth、Awdth、Pwsth及LVEF等指标上较AS低剂量组改善更为明显(q均>4.04，P<0.05)。见表3。

表3 AS改善了心梗后心室重构

2.3AS对心室重构相关基因的影响各组心室重构相关基因水平差异均有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，模型组小鼠心脏组织MMP-2、MMP-9基因表达显著升高(q均>21.02，P<0.01)，而TIMP-2表达下调(q均>29.90，P<0.01)。与模型组比较，AS低/高剂量组则明显得到缓解(q均>6.53，P<0.05)，其中AS高剂量组对重构相关基因的逆转更为明显，差异有统计学意义(q均>10.21，P<0.05)。详见表4。

表4 AS对心室重构相关基因的影响

2.4AS对心肌炎性因子及RNF10-P65关键信号基因表达的影响

各组心肌炎性因子及RNF10-P65关键信号基因表达水平差异均有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，模型组小鼠的心肌炎症基因[白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)]表达显著升高(P<0.01)，而P65表达上升(P<0.01)，关键因子RNF10表达显著下降(P<0.01)。与模型组比较，AS低剂量组和高剂量组炎性因子及P65水平显著降低，RNF10水平升高(P<0.05或P<0.01)，且高剂量组更为明显(P<0.05)。见表5。

3 讨 论

AMI发生后，即使血运重建，患者后期心室重构所导致的心力衰竭仍不容忽视[13,14]。在这一病理生理过程中，大量信号蛋白及功能蛋白不断生成与降解。作为细胞内蛋白质降解的主要途径，泛素蛋白酶体系统(Ubiquitin Proteasome System，UPS)起到了重要的平衡作用[15]。特别是心肌受损时，心肌UPS系统明显激活，调控大量信号蛋白的生成降解，直接影响心肌组织能量代谢、凋亡自噬、心肌间质纤维化等[16]。RNF10是UPS 中一类重要的调控因子，广泛表达于哺乳动物的各组织，且在不同种属间高度保守[17]。既往研究证实RNF10参与了糖脂代谢紊乱及炎症调控[18]。本课题组前期研究也证实了RNF10可以调控血管平滑肌的增殖与凋亡[6,7]。在心肌组织中，RNF10也能影响心肌细胞的炎症与凋亡，而这一关键调控原件就是NF-κB(数据尚未发表)。因此，我们提出RNF10-NF-κB轴是心血管发育的关键信号通路并拥有强大的抗炎抗凋亡作用，但如何激活尚不清楚。

表5 AS对炎症因子及RNF10-P65信号基因表达的影响

作为黄芪的主要活性成分，AS已被证实具有广泛的药理学作用[9]。在心血管领域，已证明其能够保护心肌细胞、抗缺血、抗心律失常、延缓动脉粥样硬化、对抗左室肥厚等[19]，主要作用靶点为炎症与凋亡的调控。但令人疑惑的是现有的抗炎机制不能完全解释其作用，我们推测有其它抗炎机制参与其中。因此，本文观察了AS对心室重构的影响以及是否发挥调控RNF10-NF-κB通路及其下游炎性因子的作用。

本研究确实证明了AS不能降低心梗后心脏破裂发生率，但在心室重构方面，AS的改善效应的确很明显，能显著抑制心脏扩大。分子生物学研究揭示其可能通过抑制RNF10-NF-κB途径发挥强烈的抗炎作用，抑制了包括IL-6、TNF-α、VCAM-1等在内的炎症基因活化，进而减轻了急性期心室水肿。持续的抗炎作用还减轻了MMP的激活，对后期心室扩张及纤维化起到了阻滞作用，最终抑制了心室重构。

该研究有几点值得指出，(1)各组在死亡率方面没有显现出差异。可能是因为样本量较小，也有可能与早期AS干预时间不足相关；(2)80mg/kg AS在小鼠心室重构的防治可能更具有有效性。相比低剂量组，尽管高剂量AS在心脏破裂发生率及心脏扩大(LVEDD、LVESD变化不大)中未显现出差异。但可以看到AS高剂量组大鼠Awsth、Awdth、Pwsth改善更为明显，更强烈地抑制了炎性因子释放及MMP活性，若增加样本量及观察时间或可观察到更明显的抗重构效应性；(3)本研究首次提出AS可能通过RNF10-NF-κB通路减少炎症损害及MMP所致纤维化，进而改善心梗后心室重构。尽管既往研究认为AS可抑制压力超负荷诱导的心室重构[8]，但其具体作用机制完全不同，有可能不同心室重构条件下涉及的信号转导途径不同，也有可能为多信号途径转导，尚需进一步证实。

综上所述，本研究证实了AS减轻了AMI大鼠血清炎症程度并降低了MMP水平，改善了心梗后的心室重构。这一作用可能是通过调控RNF10-NF-κB这一关键信号通路，继而减少炎性因子释放及MMP所致纤维化而实现。本研究结果将有助于后续药物的研发及改良，最终为心梗后心室重构患者提供新的药物选择。

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