空肠弯曲菌多重毒力基因检测方法的建立

聂文芳,宋 清,腾 军,陈 伟

(合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)是人畜共生的食源性致病微生物,广泛分布于自然界中,其感染途径以食用生的、未熟透的禽肉和消毒不充分的牛奶为主[1-5]。人感染空肠弯曲菌后,最常见的会引起肠胃炎、腹泻、发烧以及腹部绞痛,并伴随有反应性关节炎、肝炎、瑞特氏病和格林-巴利综合征等免疫性损伤性疾病[6-9]。世界卫生组织已将空肠弯曲菌引起的肠炎列为最常见的传染病之一,我国国家食源性疾病监测网也将弯曲菌列为监测对象。

细胞溶涨毒素(cytolethal distending toxin，CDT)是目前空肠弯曲菌分泌表达的唯一细胞毒素,cdt基因簇由cdtA、cdtB、cdtC串联组成,且cdtB在细胞毒素的分泌过程中起着决定性的作用。空肠弯曲菌作为引起腹泻的主要细菌之一,建立有效的快速检测空肠弯曲菌毒力基因的方法已经成为控制该类感染性疾病的关键。传统的检测方法不仅耗时费力、且成本高,不适用于现场检测[10-12]。

目前用于检测空肠弯曲杆菌的方法主要有聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)、ELISA、RT-PCR、PCR-ELISA和多重PCR等[13-22],其中适合大批量样品检测及血清学调查的主要是ELISA和RT-PCR方法。然而,现有的ELISA方法还不能对空肠弯曲杆菌肠炎做出准确的诊断,RT-PCR方法虽然可以对空肠弯曲杆菌准确检测,但是由于其操作复杂,需要特异的引物、昂贵的实验仪器设备和专业的实验人员而不能适应现场快速检测的要求。

本研究提出了胶体金免疫层析试纸条结合 PCR预扩增的方法,利用双修饰的引物经预扩增后得到两端带有识别物的双链分子:一端与金标抗体结合;另一端再与试纸条上的检测线结合显色。根据细菌浊度的大小在试纸条上会显示出不同程度的颜色,其颜色强度可直接用肉眼观察出来,以此来建立空肠弯曲菌毒力基因的快速检测新方法,以提高空肠弯曲菌的检测限,并达到短时快速检测的要求。

此外,试纸条成本低廉,固定于卡片盒中,适用于大批量生产使用,可以很好地替代RT-PCR和ELISA等方法,应用于大批量、大范围的空肠弯曲杆菌肠炎病学的调查研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌种及背景

实验所用菌株均来自于江苏南京出入境检验检疫局,其中阳性对照为空肠弯曲菌,阴性对照为大肠杆菌O157∶H7、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌ATCC33847。

1.1.2 实验仪器与试剂

电热恒温水浴锅、PCR扩增仪、凝胶成像系统、恒温培养箱和电泳仪等;蛋白酶K、链霉亲和素、特异性的PCR引物、地高辛抗体和FITC抗体均购自上海生物工程有限公司;吸水垫、样品垫、金标垫和硝酸纤维素膜均购自上海捷宁生物有限公司。

特异性的PCR引物序列为:

mapA-F:5’-Dig-CTATTTTATTTTTGAGTGCTTGTG-3’,

mapA-R:5’-Biotin-GCTTTATTTGCCATTTGTTTTATTA-3’,

预期扩增片段大小为589 bp;

cdtB-F:5’-FITC-CAGAAAGCAAATGGAGTGTT-3’,

cdtB-R:5’-Dig-AGCTAAAAGCGGTGGAGTAT-3’,

预期扩增片段大小为620 bp。

1.2 方法

1.2.1 模板DNA的制备

取1 mL不同浊度的空肠弯曲菌菌液10 000g离心7 min,沉淀溶于700 μL裂解液,65 ℃水浴10 min,加入1/2体积的磁珠吸附液振荡反应10 min,磁性分离去上清,沉淀用70%乙醇清洗后烘干,再溶于TE缓冲液65 ℃水浴10 min,收集上清液即为所制备的DNA样品,4 ℃保存备用[23]。

1.2.2 普通PCR预扩增

PCR预扩增体系包括10×PCR buffer,MgCl2,dNTPs,特异性的引物,Taq DNA聚合酶,致病菌DNA模板及双蒸水。PCR预扩增条件为:95 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,51～55 ℃退火45 s,72 ℃延伸30 s,共35个循环;72 ℃再延伸2 min。反应结束后取5 μL扩增产物于2.0%琼脂糖凝胶中,电泳观察扩增条带。剩余PCR产物于-20 ℃保存备用。

1.2.3 胶体金与金标垫的制备

50 mL蒸馏水倒人锥形瓶中,滴加850 μL 5 mg/mL氯金酸,加热到微沸,再滴加900 μL 1%柠檬酸三钠同时搅拌,当溶液颜色由紫红色变成红色时,继续搅拌加热5 min即可,冷却,于4 ℃冰箱中保存。

取1 mL制备好的胶体金溶液,用K2CO3,调至pH值约为8,再加入4 μL抗体振荡反应1 h后,再加入1/10体积的10% BSA,继续振荡反应0.5 h,以9 600g离心7 min,产生红色沉淀;10% BSA 100 μL复溶后均匀滴加到玻璃纤维上30 ℃干燥,备用。

1.2.4 胶体金双重试纸条的组装

试纸条由样品垫、金标垫、NC膜和吸水垫4个部分组成。首先将羊抗鼠二抗、FITC抗体和SAV用10 mmol/L PB(pH值为7.4)稀释至1 mg/mL用喷膜仪依次喷至NC膜上,作为质控线和2条检测线,37 ℃烘10 min后取出,最后将样品垫、金标垫、NC膜和吸水垫依次粘贴在塑料底板上,用切条机切割成4 mm宽的试纸条保存备用。

1.2.5 试纸条的检测1.2.5.1 不同封闭剂的优化

在胶体金与标记抗体偶联过程中,加入不同的封闭剂(10% BSA,10% HSA,0.5% OVA,0.5% Casein和0.5% Na-Casein),确定最适宜的封闭条件。

1.2.5.2 灵敏度检测

取不同浊度空肠弯曲菌(107、106、105、104、103、102、101、0 CFU/mL)的预扩增产物用10 mmol/L PB稀释10倍上样,10 min后肉眼观察其显线情况。

1.2.6 特异性检测

利用大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、志贺氏菌和副溶血性弧菌ATCC33847的基因组DNA为模板扩增,再将得到的产物用于做特异性实验,同时以空肠弯曲菌作为阳性对照。

1.2.7 实际样品检测

采用本实验建立并优化的空肠弯曲杆菌毒力基因多重胶体金的检测方法,对牛奶样品进行检测,并对其结果进行分析。

2 结果与分析

2.1 检测原理

空肠弯曲菌毒力基因多重检测的原理如图1所示。

对用于PCR扩增的上下游引物分别修饰上识别基团或分子,即mapA上下游引物分别修饰有Digoxin和Biotin,而cdtB上下游引物分别修饰有Digoxin和FITC。当2种目标DNA都存在时,经过PCR后可分别得到两端带有Digoxin和Biotin及Digoxin和FITC的双链DNA分子,再用于试纸条检测时,即可观察到C线和2条T线;若只有1种目标DNA存在时,只能观察到C线和其中的1条T线;若2种目标DNA都不存在时,在试纸条上就只能观察到C线。

2.2 空肠弯曲菌mapA和cdtB预扩增

取107、106、105、104、103、102、101、0 CFU/mL的空肠弯曲菌保守序列mapA和毒力基因cdtB的预扩增产物5 μL进行琼脂糖电泳验证其扩增效果。已知mapA的目的片段为589 bp,cdtB的目的片段为620 bp。本研究所得的空弯mapA和cdtB基因的琼脂糖电泳结果如图2所示,图2中显示的结果正好与此相印证,并且没有其余的杂带和引物二聚体,说明扩增效果很好,且灵敏度能达到102、101CFU/mL。图2中，M表示Marker;1～8依次表示空肠弯曲菌浊度为107、106、105、104、103、102、101、0 CFU/mL

图2 mapA和cdtB在空肠弯曲菌中的电泳结果

2.3 封闭剂种类的选择

免疫层析试纸条制备过程中封闭剂的选择对于其检测的灵敏度高低极为重要。用制备的试纸条对已知空白样品进行检测,优化结果如图3所示,比较10% BSA、10% HSA、0.5% OVA、0.5% Casein和0.5% Na-Casein 5种封闭剂,mapA和cdtB的检测结果显示只有BSA和OVA没有假阳,再根据质控线的显线强度比较可知BSA封闭显线强度较高,因此确定偶联封闭剂为10% BSA。

图3 mapA和cdtB在不同封闭剂下的试纸条优化结果

2.4 空肠弯曲菌的敏感性检测结果

2.4.1mapA和cdtB的单重检测结果

制作好的免疫胶体金试纸条于肉眼下观察,10 min即可出现结果。分别对空肠弯曲菌中的保守序列mapA和毒力基因cdtB利用双重试纸条进行敏感性检测,其结果如图4所示。

图4 mapA和cdtB的单重检测结果

从图4可以看出,在只有mapA或者cdtB独立存在的情况下,随着空肠弯曲菌从101CFU/mL增大到107CFU/mL,检测线的显线强度也逐渐增强,且mapA基因在105CFU/mL之后保持稳定不变,而cdtB基因也在106CFU/mL之后到达平衡。结果表明,mapA和cdtB互相之间不存在交叉现象。

2.4.2mapA和cdtB的多重检测结果

同时对空肠弯曲菌中的mapA和cdtB进行敏感性检测,即将两者的预扩增产物稀释后混合上样,10 min后观察结果如图5a所示,图5a中1～8依次表示空肠弯曲菌浊度为107、100、105、104、103、102、101、0 CFU/mL,由图5a可知，随着空肠弯曲菌浊度的增大,2条T线颜色均逐渐增强,且灵敏度皆可达到101CFU/mL,同时都在106CFU/mL处达到稳定。

再根据显色结果对C、T线作出峰型图以及根据峰型图得出的线性图,结果如图5b和图5c所示,T1线和T2线的峰高均随着细菌浊度的增大而逐渐增大。结果表明,在101～107CFU/mL范围内,所建立的免疫胶体金检测方法对mapA和cdtB的同时检测具有良好的线性关系。

图5 mapA和cdtB的双重检测结果

2.5 特异性验证

提取大肠杆菌、沙门氏菌等7株实验菌株的基因组DNA,以它们为模板,用扩增的空肠弯曲杆菌引物进行PCR,再用已建立的方法对得到的产物进行检测,结果如图6a所示。

图6 mapA和cdtB的特异性检测结果

图6a中，1～9依次为mapA与cdtB混合物、mapA、cdtB、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄葡萄球菌、单增李斯特菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌。从图6可以看出，1～3号的T线出现显线,其余均只有C线显线,即只有在空肠弯曲菌存在的情况下才显线,同时对显线结果做出了峰型，结果如图6b所示,从图6b也可以看出此方法的特异性很强。

2.6 牛奶样品的检测结果

将1 mL的空肠弯曲菌原液添加于9 mL牛奶样品中,再取出1 mL用于基因组DNA的提取,并进行PCR扩增,同时双蒸水作为阴性对照,再将产物用于试纸条检测,结果如图7所示,其中图7b、7c分别为峰型图和线性结果。

用PCR预扩增再经由胶体金试纸条检测所得的灵敏度依然可以达到101CFU/mL，从而说明了此方法的可靠性和有效性。

(c)图7 实际样品的检测结果

3 结 论

空肠弯曲杆菌作为目前受到国内外广泛重视的一种人畜共患病原菌[24-25],本文建立于PCR基础上的胶体金免疫层析试纸条检测方法包括对目的基因预扩增和对扩增产物的试纸条检测2个部分,能快速(肉眼在10 min内)、准确、灵敏地判定结果,操作简单,即使不是专业的人员也可以现场使用[26-28]。此外该方法利用了PCR的高效性和试纸条检测的快速简便性,具有较高的敏感性和特异性,在牛奶样品中可以检测到101CFU/mL,相对于琼脂糖电泳图的结果提高了10倍。同时也保证了检测的时效性和准确性,适用于实时检测。

本研究成功建立了空肠弯曲杆菌免疫层析检测方法,研制的试纸条对空肠弯曲杆菌具有很高的特异性和敏感性。实时验证结果表明,试纸条使用方便、快捷、且操作简单,适合对空肠弯曲杆菌感染进行现场早期检测及鉴别诊断。本方法的建立为空肠弯曲杆菌的现场早期检测奠定了基础。