张弓老酒大曲中高产酯化酶细菌的分离筛选及产酶条件优化

刘延波，唐艳彦，赵志军，侯文静，孙西玉,2，潘春梅

(1.河南牧业经济学院食品与生物工程学院(酒业学院)，河南牧业经济学院河南省白酒风格工程技术研究中心，河南牧业经济学院郑州市白酒酿造微生物技术重点实验室，河南 郑州 450046；2.张弓老酒酒业有限公司，河南 宁陵 476733)

中国白酒时代久远，工艺精湛，口味醇厚，是中国特有的一种蒸馏酒[1-2]，浓香型白酒占全国的白酒产量的大多数.酒曲在白酒酿造过程中发挥着重要的作用[3]，其具有糖化、酒化、发酵、生香的功能[4]，为白酒提供内在动力，有“大曲是酒之骨”说法，即其品质的优劣往往对白酒的出酒率以及酒质都有极大的影响[5-6].

大曲是以生料小麦为主要原料再经固态法发酵制作的发酵剂[7-8].在制曲过程和发酵培菌管理中包罗了自然环境中的大量微生物，使酒曲成品中含有丰富的酿酒微生物菌系和酶系[9-10].目前已知的在浓香型白酒酿造环节中产酯化酶的菌株为霉菌、酵母菌和细菌，其中霉菌以红曲霉、根霉和毛霉等为主，酵母菌主要是生香酵母为主，而在细菌中很少出现代表性菌株[11-13].这其中的一些微生物在特殊环境下进行生长繁殖及代谢，各种代谢物在酶的作用下发生酯化反应而生成白酒的酯类和香气物质[14].

白酒中酯类物质众多并且在生香过程中起着重要的作用，酯化酶是一种将酸和醇催化成酯的酶类[15]，不同微生物产生酯化酶的酶学性质、酶量的多少和酶活的高低都与白酒的优质品率密切相关[16].由于酯化酶本身结构的复杂多样，进而造成其研究远远不如淀粉酶、蛋白酶[17].前人对酿酒大曲中高产酯化酶菌株的筛选鉴定研究有较多报道，但大部分菌株以生香酵母、霉菌为主[15]，关于细菌中产酯化酶研究较少[18].因此本试验通过从张弓老酒大曲分离鉴定高产酯化酶细菌并研究其生理生化和产酶条件，为后续提高大曲酯化力提供菌种，有效控制制曲工艺与酒曲质量，以期对提升白酒大曲品质和白酒的优质品率提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 浓香型大曲：由张弓老酒酒业有限公司提供.

1.1.2 主要试剂 三丁酸甘油酯：上海麦克林生化科技有限公司；聚乙烯醇：可乐丽株式会社；氯化钠：天津市科密欧化学试剂有限公司；牛肉膏、蛋白胨：北京澳博星生物技术有限公司；柱式细菌基因组 DNA抽提试剂盒：天根生化科技有限公司.

1.1.3 培养基 筛选培养基(g/L)：牛肉膏3，蛋白胨5，琼脂25.乳化液：将3%的聚乙烯醇溶液和三丁酸甘油酯按体积比9∶1搅拌混合.将培养基与乳化液按体积比4∶1混合，自然pH.

种子液培养基细菌(g/L)：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl 5，自然pH.

发酵培养基(g/L)：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl 5，自然pH.

1.2 仪器

振荡培养箱：上海知楚仪器有限公司；恒温培养箱：上海新苗医疗器械制造有限公司；高压灭菌锅：上海申安医疗机械厂；恒温水浴锅：常州方科仪器有限公司；超净工作台：苏州净化设备有限公司等.

1.3 方法

1.3.1 菌种初筛 从大曲不同层次取样并研细成粉，称取25 g于225 mL装有玻璃珠的无菌水中，浸泡30 min然后取上清液用无菌水配制成菌悬液，后进行梯度稀释.选取合适的梯度均匀涂布于平板筛选培养基上，每个稀释度做3个平行样.将接种好的平板置于37 ℃恒温培养箱中培养3 ～4 d观察在菌落周围出现的透明圈[19]，并测量透明圈直径(D)与菌落直径(d)之比.选择其比值大的菌落进行纯化，于筛选平板上划线分离至纯种，将筛选得到的菌株编号并保藏于20%的甘油管中，置于-20 ℃冰箱中保存[23].

1.3.2 菌种复筛 将初筛获得的D/d比值较大的菌株在筛选平板上活化后，接种于10 mL液体种子培养基中，于37℃、180 r/min恒温振荡培养48 h.所得发酵液在4℃、10 000 r/min条件下离心10 min，去沉淀，取上清液即为粗酶液，4℃保存[20].进行酯化酶活力测定：取4 mL乳化液(取90 mL聚乙烯醇溶液加入10 mL三丁酸甘油酯，充分摇匀配成100 mL的乳化液)和5 mL的磷酸缓冲液(0.025 mol/L，pH 7.5)于锥形瓶中，放入40 ℃水浴锅中，预热5～10 min，加入1 mL粗酶液，同时计时；反应15 min，加入15 mL 95%乙醇，滴2～3滴酚酞指示剂，并用0.05 mol/L NaOH溶液滴定.不加酶液的为对照[21-22].

酶活力计算公式：

式中：V1为消耗的NaOH溶液体积；V2为空白对照；n为稀释倍数；t为反应时间.

1.3.3 形态鉴定 用显微镜观察菌落的生长、颜色、表面形态、质地、边缘形状等；对其进行革兰氏染色，个体形态特征.

1.3.4 16S rDNA分子测定 将复筛获得酶活性最高的菌株于液体培养基中，过夜培养，利用柱式细菌基因组 DNA抽提试剂盒提取复筛得到的高产菌株的基因组DNA，并以获得的DNA为模板，用细菌16 S rDNA通用引物27F(5＇-AGAGTTTGATAGAGTTTGATC-3＇)/1492R(5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇)为上/下游引物进行 PCR扩增.PCR扩增反应程序：94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，35个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃下保存.PCR扩增反应体系(50 μL)：Mix25 μL，DNA样品1 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，蒸馏水20 μL.

应用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，然后送上海生工生物工程有限公司测序.序列结果用NCBI在线工具Blast在GeneBank内与标准菌株比对，找出与克隆子序列同源性最高的序列，根据其同源性构建系统发育树并明确其分类地位.DNAMAN软件对齐序列，利用MEGA6.0软件构建系统发育树[23-25].

1.3.5 生理生化鉴定 将目标菌株进行生理生化试验并与细菌手册对比[26-27].

1.3.6 单因素试验对产酯酶活的影响

1)最适碳源及最适添加量的确定 分别以1 g/mL的淀粉、葡萄糖、蔗糖、玉米粉和酒糟粉为碳源(各做3个平行)，代替发酵培养基的碳源，其余成分不变，每100 mL摇瓶装10 mL液体发酵培养基，接种菌液1.5 mL，37 ℃、150 r/min振荡培养48 h后测定酶活力，优选出最适碳源.然后再以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g的最适碳源与普通液体培养基产酶酶活进行对比试验，以确定最佳碳源的最适添加量[28].

2)最适氮源及最适添加量的确定 分别以0.3 g/mL硫酸铵、牛肉膏、蛋白胨、豆粕粉、酵母膏为氮源(各做3个平行)，代替发酵培养基的氮源，其余成分不变，每100 mL摇瓶装 10 mL液体发酵培养基，接种菌液1.5 mL，37 ℃、150 r/min振荡培养48 h后测定酶活力，优选出最适氮源.然后以0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g的最适氮源与普通液体培养基产酶酶活进行对比试验，确定最佳氮源的最适添加量[28].

3)最适pH值的确定 分别以不同发酵初始pH值(3、4、5、6、7、8)，每100 mL摇瓶装10 mL液体筛选培养基，接种菌液1.5 mL ，37 ℃、150 r/min水浴振荡培养48 h后测定酶活力与普通液体培养基产酶酶活进行对比试验，确定最适pH值[29].

1.3.7 响应面试验 通过Design-Expert 8.0.6软件进行Box-Benhnken响应面设计，选择对酶活影响较大的三因素三水平，进行响应面试验以此得到产酶的最适条件[30].

1.4 数据处理

数据分析采用Excel 2013进行作图，Design-Expert 8.0.6进行显著性差异分析与回归方程拟合.

2 结果与分析

2.1 酯化酶菌株初筛

将大曲不同区域内取样进行稀释涂布后，37 ℃培养箱倒置培养48 h，得到200株具有水解圈的菌株，后进行透明圈直径(D)和菌株直径(d)测量，并进行D/d值进行比较，得出比值较大的15株.初筛结果见表1.从表1可得菌株T-15的D/d值最大为3.75，菌株T-76、T-87的D/d值较大，T-92的D/d值最小为1.77，进而对D/d值较大的前10株菌株进行复筛.

表1 产酯化酶菌株的初筛

2.2 酯化酶菌株复筛

通过酸碱滴定法对这些D/d比值较大的菌株进行产酶条件测试，酶活测定结果见表2.

从表2里可以看出T-15菌株产酯化酶酶活最高，达到41.67 U/mL明显优于其它菌株，选择T-15菌株进行后续试验.

2.3 菌落形态

通过显微镜观察，其菌落颜色呈白色，边缘整齐，粘稠光滑，菌体为圆球状，鉴定结果为革兰氏阳性菌.其菌落图片见图1.

表2 产酯化酶菌株的复筛

2.4 菌株T-15的分子生物学鉴定

将提取的菌株T-15的基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增结果如图2所示.由图可知所扩增得到的片段的电泳条带亮度大，无拖尾，分子量大小在1 500 bp左右，与目的片段大小一致.进而将PCR扩增产物进行测序，将测得的菌株T-15的16S rDNA基因序列与NCBI数据库内其他菌株的16S rDNA基因序列应用Blast软件进行对比，发现该菌株与与公布的EIV-7(登录号：FJ613565.1)同源性达到97%，因此初步鉴定为葡萄球菌属.应用MEGA 6.0软件构建NJ(Neighbor -joining)系统发育树，菌株T-15的系统发育树见图3.

图1 T-15菌株的菌落形态Figure 1 Colony morphology of T-15

图2 PCR凝胶电泳结果Figure 2 Results of gel electrophoresis PCR

2.5 生理鉴定

通过试验确定此菌株能分解葡萄糖、麦芽糖和蔗糖，产酸不产生气以及产生色素为白色.并且与细菌手册对比后鉴定为.结合生理生化试验结果和16S rDNA分子鉴定，可确定菌株T-15为表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis).

2.6 产酶条件单因素优化

2.6.1 pH对产酯化酶活力的影响 将菌液接入不同的pH的液体培养基中进行培养，测定酶活力.不同pH液体培养基对产酯化酶的影响如图4所示.由图4结果可知T-15菌株在pH为3到4范围内的酶活力呈上升趋势，直到pH为4，酶活力达到最大，为33.73 U/mL，随后酶活力随着pH的增长而呈下降趋势.

图3 菌株T-15系统发育树Figure 3 Strain T-15 phylogenetic tree

图4 不同pH值对菌株产酯化酶能力的影响Figure 4 The effect of different pH values on the strain's ability to produce esterase

2.6.2 碳源的选择及所选碳源最适添加量的确定 将菌液接入不同的碳源的液体培养基中进行培养，测定酶活力，结果如图5所示.将菌液接入最优碳源不同添加量的液体培养基中进行培养，测定酶活力，其结果如图6所示.

由图5可知T-15菌株培养基最佳碳源为玉米粉，其酶活最大为58.47 U/mL；淀粉为碳源时测得酶活最低为33.12 U/mL.由图6可得玉米粉添加量从0.5到2.0 g范围内的酶活力呈上升趋势达到酶活力达到最大，为26.12 U/mL，随后酶活力下降.

2.6.3 氮源的选择所选氮源最适添加量的确定 将菌液接入不同的氮源的液体培养基中进行培养，测定酶活力，结果如图7所示.将菌液接入最优氮源不同添加量的液体培养基中进行培养，测定酶活力，其结果如图8所示.

图5 不同碳源对菌株产酯化酶能力的影响Figure 5 The effect of different carbon sources on the strain's ability to produce esterase

图6 碳源最适添加量的确定Figure 6 Determination of the optimal amount of carbon source

图7 不同氮源对菌株产酯化酶能力的影响Figure 7 Effect of different nitrogen sources on the ability of strains to produce esterase

由图7可知，T-15菌株培养基最佳氮源为酵母粉，其酶活最大为86.84 U/mL，其次为牛肉膏81.56 U/mL，豆粕粉作为氮源时酶活最低.在图8中可得在酵母粉添加量从0.2到0.5范围内的酶活力呈上升趋势达到酶活力达到最大，为35.56 U/mL，随后酶活力下降.

图8 氮源最适添加量的确定Figure 8 Determination of the optimal amount of nitrogen source

2.7 T-15菌株的发酵条件的响应面优化

2.7.1 响应面试验设计及结果 根据单因素试验对菌株T-15的影响，选取各因素中最适水平及左右水平，采用三因素三水平法A- pH、B-玉米粉、C-酵母粉，利用Design-Expert 8.0.6软件进行Box-Benhnken响应面设计.响应面试验的设计与结果，如表3所示.

表3 响应面试验设计与结果

2.7.2 回归模型的建立及其显著性检验 通过Design-Expert 8.0.6软件对表3的结果进行二次多元回归拟合，建立二次响应面回归模型为：酶活=79.27-2.61×A-0.34×B-6.54×C-1.42×A×B+6.64×A×C+6.83×B×C-27.45×A2-23.86×B2-21.49×C2回归系数显著性分析和模型的方差分析，如表4所示.由表4可知，该模型P<0.001，失拟项P=2.14>0.05可知该模型回归显著，失拟项不显著，不需要引入更高次项系数.模型的校正复相关系数R2=0.991 7，说明各个因素对响应值的线性关系是显著的，拟合良好，所以该模型能模拟该试验的理论预测.校正复项关系数AdjR2=0.981，Adeq Precision=23.404，说明该模型在设计区间内误差小，可信度较高.

表4 回归系数显著性分析和模型的方差分析

2.7.3 各因素交互作用的响应面图 响应面曲面可较直观地反映各因素及两两因素的交互作用对响应值的影响.酶活的等高线图与响应面三维图谱见图9～11.酵母粉对酶活的影响最大，其次是pH，玉米粉对酶活的影响最小.酵母粉与pH的交互影响较大，其次是酵母粉和玉米粉的交互作用，pH与玉米粉的交互影响最不明显.

2.7.4 最佳发酵条件的确定 根据分析所得结果即为最大酶活力时菌株T-15所需最佳发酵条件，A=3.93、B=1.99、C=0.48在此条件下理论预测最大酶活为79.911 6 U/mL，结合试验操作过程和便捷性，因此，最佳发酵条件为：pH=4、玉米粉2 g、酵母粉0.5 g.验证试验结果：酶活为83.33 U/mL，相对误差为4.10%.

图9 pH(A)和玉米粉(B)对酯化酶酶活力影响的等高线图Figure 9 Contour map of the effect of pH (A) and corn flour (B) on esterase activity

图10 pH(A)和酵母粉(C)对酯化酶酶活力影响的等高线图Figure 10 Contour map of the effect of pH (A) and yeast powder (C) on esterase activity

图11 玉米粉(B)和酵母(C)对酯化酶酶活力影响的等高线图Figure 11 Contour map of the effects of corn flour (B) and yeast (C) on esterase activity

3 讨论

根据黄丹等[28]报道，从浓香型大曲中分离得到 1株产酯化酶细菌,为血红鞘氨醇单胞菌，对该菌株产酯化酶的培养条件进行研究酶活可达18.26 U/mL；刘新宇等[31]从汾酒生产环境分离到2株红曲霉，并在固态发酵条件下测得较高酯化酶酶活2.46 U；张秀红等[32]从汾酒大曲中筛选出1株产酯化酶较高的菌株结果为葡萄球菌，酶活力可达33.33 U/mL；刘欢欢等[33]从实验室菌种保藏中心筛选获得1株高产酯化酶菌株X1，并被鉴定为血红红曲霉(Monascussanguineus)，在最适产酶条件下，酯化酶活力为315.19 U/mL.与前人相比，本研究从张弓老酒大曲分离鉴定的酯化酶菌株产酶能力处于中上水平，可将其应用到制造高酯化大曲，高酯化大曲的添加能减少用曲量，提高浓香型白酒原酒产量和质量[34].

此外关于表皮葡萄球菌也在其它香型大曲中广泛报道如：刘效毅等[35]从酱香型高温大曲分离出的菌株中存在表皮葡萄球菌；周森等[36]应用高通量测序技术解析清香型大曲微生物多样性，其中葡萄球菌较为丰富，可见此菌株在白酒酿造过程中发挥重要作用.此外响应面优化法通过对回归方程的拟合度以及响应面工艺回归模型的建立，可方便地求出相应于各因素水平的响应值[37-38]，经过响应面优化的酶活远大于初始酶活，表明应用响应面法可以对微生物产酶条件进行显著优化.

4 结论

通过涂布稀释和平板划线的方法从张弓老酒大曲中筛选出200株产酯化酶的菌株，采用酯化酶透明圈法初筛和滴定法测酶活的方法，筛选出1株高产酯化酶菌株T-15，测其酶活力为41.67 U/mL.对此菌株进行形态学，16S rDNA分子生物学和生理生化试验，确定该菌为表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidisstrain).进而对菌株T-15进行液体培养基条件优化，氮源、碳源和pH这3个单因素试验，结果为氮源最优为酵母粉并且最适量是0.5 g，碳源最优为玉米粉并且最适量为2 g，pH为4.根据单因素的菌株的影响，采用响应面试验设计法，以氮源、碳源最适量和pH为自变量，以酯化酶活力为响应值，对其进行响应面的优化.确定最佳发酵条件为：pH=4、玉米粉2 g、酵母粉0.5 g，优化后，其酶活力高达83.33 U/mL，比之前高50.24%.