疏肝清热通络方对糖尿病大鼠脂肪酸合成酶及心肌AMPK/ eNOS 信号通路的影响

王坤玲，连 军，周诗颖，李 林

（1.新疆医科大学第一附属医院中医科，乌鲁木齐 830011；2.新疆医科大学实验室与设备管理处动物实验中心，乌鲁木齐 830011；3.新疆医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，乌鲁木齐 830011）

2 型糖尿病患者机体血糖水平长期处于异常状态，常会引起体内血脂代谢异常，诱发或加重机体内多种脏器的炎症损伤，导致心肌结构及功能受损[1-2]。FAS 是与机体脂肪生成及代谢密切相关的代谢酶，主要分布于肝脏及脂肪组织中，并以在肝脏中表达为主[3]。AMPK/eNOS 信号通路及其相关蛋白水平异常与糖尿病及心肌损伤的发生密切相关[4-5]。疏肝清热通络方是以传统中医药理论为指导，治疗2 型糖尿病疗效显著[6]，而其对于脂肪酸合成酶及心肌AMPK/eNOS 信号通路的影响目前尚未见报道。本研究观察疏肝清热通络方对于2 型糖尿病大鼠肝脏脂肪酸合成酶及心肌AMPK/eNOS 信号通路的影响，以期为疏肝清热通络方对于脂肪代谢及心肌损伤的保护作用研究提供新的参考和依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级成年雄性SD大鼠，6～8周龄，体质量（180±20）g，购于新疆医科大学实验动物中心，动物房温度（22±2）℃，湿度（50±10）%，适应性喂养1 周后进行实验。

1.2 药物与试剂 疏肝清热通络方（SQT）（柴胡15 g，郁金10 g，黄芩10 g，黄连10 g，大黄10 g，芍药10 g，当归6 g，丹参10 g，水蛭10 g）由药材饮片制成每毫升含1 g 生药的制剂，购于北京同仁堂股份有限公司（批号：201903282）；链脲佐菌素（STZ）购自美国 Sigma 公司（批号：201907131）；SOD 活性检测试剂盒及MDA 检测试剂盒，AMPKα1、p-AMPKα1、eNOS、p-eNOS 及GAPDH 抗体购自碧云天生物科技有限公司（货号：S0103、S0131M、AF1627、AF2677、AF6792、AF5812、AF1186）；磷酸酶抑制剂复合物购自上海生工生物公司（货号PL107）；糖化血红蛋白酶联免疫吸附（ELISA）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所（批号：201812112）。

1.3 主要仪器 DM500 显微镜购自德国Leica 公司；AllegraX30R 多功能离心机购自美国Beckman 公司；Multiskan GO 酶标仪购自美国Thermo Fisher 公司；ChemiDoc XRS 型凝胶成像仪购自美国Bio-Rad 公司；ACCU-CHEK Active 血糖仪购自罗氏诊断产品（上海）有限公司。

1.4 造模与分组 除15 只大鼠作为对照组外，其余60 只大鼠参照文献[7]建立2 型糖尿病模型大鼠。具体方法为：给予大鼠高脂饲料喂养4 周后，根据大鼠体质量按照25 mg/kg 腹腔注射1% STZ，1 周后按照40 mg/kg 再次腹腔注射给予大鼠1% STZ，常规喂养3 d 后自尾静脉采血，使用血糖仪测定血糖，连续3 d 大鼠血糖浓度均＞16.7 mmol/L 以及尿糖达+++～++++视为2 型糖尿病大鼠模型建立成功。

1.5 实验给药 将造模完成后的大鼠按照体质量随机分为模型组、SQT 低、中、高剂量组，15 只/组。以SQT 的临床使用剂量为参考，通过剂量换算后[8]，SQT 低、中、高剂量组大鼠分别根据大鼠体质量按照10、20、30 g/kg 的剂量灌胃予大鼠SQT，对照组及模型组灌胃予大鼠等量生理盐水，每日1 次，连续给药8 周[9]。最后1 次给药24 h 后，大鼠禁食不禁水12 h 后，尾静脉取血后使用血糖仪检测大鼠空腹血糖水平。

1.6 观察指标

1.6.1 大鼠糖化血红蛋白水平测定 大鼠通过眼眶后静脉丛取血，按照ELISA 试剂盒说明书检测大鼠糖化血红蛋白水平。

1.6.2 大鼠血清FFA、TG、TC、LDL-C 水平测定 取大鼠血清，进样至全自动生化分析仪，测定大鼠血清FFA、TG、TC、LDL-C 水平。

1.6.3 大鼠肝组织FAS mRNA水平测定 大鼠处死后分离肝组织，提取总RNA 并逆转录成cDNA，定量PCR检测肝组织FAS mRNA 水平。引物序列为：FAS，正向引物：5′-AGCCCGGCCAGCGATACAGA-3′，反向引物：5′-GGACCACCCGGGCCATAGGT-3′；β-actin，正向引物：5′-AGAGTCGCGAGCTTGATCTT-3′，反向引物：5′-TTGGAATAGGGGACCTCGTG-3′，结果采用2-△△Ct法计算相对表达量。

1.6.4 大鼠心肌组织SOD 活性及MDA 水平测定 取大鼠心肌组织，按照试剂盒说明书检测心肌组织SOD活性及MDA 水平。

1.6.5 大鼠心肌组织病理学检查 取心肌组织，在中性甲醛中固定，石蜡包埋，并进行5 μm 切片，按照苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE 染色）步骤进行染色后，使用光学显微镜观察大鼠肾组织病理学变化。

1.6.6 Western blot 检测大鼠心肌组织AMPKα1、p-AMPKα1、eNOS、p-eNOS 蛋白水平 取大鼠心肌组织加入RIPA 蛋白裂解液及磷酸酶抑制剂，在玻璃匀浆器匀浆，4 ℃，12 000 rpm 离心10 min，取上清液于100 ℃水浴5 min 变性处理，BCA 法测定蛋白浓度后，取50 μg 蛋白进行SDS-PAGE 电泳分离，转膜。封闭液室温封闭1 h 后，经AMPKα1、p-AMPKα1、eNOS、p-eNOS 及GAPDH 抗体（1:1 000）4 ℃孵育过夜。PBST 充分洗膜后，加入二抗（1:2 000）室温条件下再次孵育1 h，PBST 清洗后在蛋白条带上加入显色液显影，并利用凝胶成像仪成像后，应用Image J 软件进行免疫印迹灰度值定量分析。

1.7 统计学方法 应用SPSS 19.0 对数据进行处理，Graphpad prism 5 绘图，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，计量资料用均数±标准差（）表示，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠空腹血糖及糖化血红蛋白水平比较 见表1。

表1 各组大鼠空腹血糖及糖化血红蛋白水平比较（，n =15）

表1 各组大鼠空腹血糖及糖化血红蛋白水平比较（，n =15）

注：与对照组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05；与SQT 低剂量组比较，▲P ＜0.05；与SQT 中剂量组比较，□P ＜0.05

2.2 各组大鼠肝组织FAS mRNA 水平比较 见表2。

表2 各组大鼠肝组织FAS mRNA 水平比较（，n =15）

表2 各组大鼠肝组织FAS mRNA 水平比较（，n =15）

注：与对照组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05；与SQT 低剂量组比较，▲P ＜0.05；与SQT 中剂量组比较，□P ＜0.05

2.3 各组大鼠心肌组织SOD 活性及MDA 水平比较 见表3。

表3 各组大鼠心肌组织SOD 活性及MDA 水平比较（，n =15）

表3 各组大鼠心肌组织SOD 活性及MDA 水平比较（，n =15）

注：与对照组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05；与SQT 低剂量组比较，▲P ＜0.05；与SQT 中剂量组比较，□P ＜0.05

2.4 各组大鼠血清FFA、TG、TC、LDL-C 水平比较 见表4。

表4 各组大鼠血清FFA、TG、TC、LDL-C 水平比较（，n =15）

表4 各组大鼠血清FFA、TG、TC、LDL-C 水平比较（，n =15）

注：与对照组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05；与SQT 低剂量组比较，▲P ＜0.05；与SQT 中剂量组比较，□P ＜0.05

2.5 各组大鼠心肌组织病理学检查结果 与对照组相比，模型组大鼠心肌细胞明显肿胀，细胞排列不整齐，可见大量炎性细胞浸润，肌原纤维结构受损严重；与模型组相比，SQT 各剂量组大鼠心肌组织病理学明显改善，SQT 低、中剂量组大鼠心肌组织细胞膜完整，炎性细胞浸润明显减轻，肌原纤维结构有所改善，SQT 高剂量组大鼠心肌细胞膜完整，偶见炎性细胞浸润，肌原纤维结构完整。见图1。

2.6 各组大鼠心肌组织AMPKα1、p-AMPKα1、eNOS、p-eNOS 蛋白水平测定结果 与对照组相比，模型组大鼠心肌组织AMPKα1、p-AMPKα1、eNOS、p-eNOS、p-eNOS/ eNOS、p-AMPKα1/ AMPKα1 水平均显著降低（P＜0.05）。与模型组相比，SQT 低、中、高剂量组大鼠心肌组织AMPKα1、p-AMPKα1、eNOS、peNOS、p-eNOS/ eNOS、p-AMPKα1/ AMPKα1 水平均显著升高（P＜0.05），且随着SQT 剂量的增加，大鼠心肌组织AMPKα1、p-AMPKα1、eNOS、p-eNOS、peNOS/ eNOS、p-AMPKα1/ AMPKα1 水平逐渐升高。见图2，图3。

图1 各组大鼠心肌组织病理学检查结果（HE 染色，×200）

图2 各组大鼠心肌组织AMPKα1、p-AMPKα1、eNOS、p-eNOS 蛋白水平比较

图3 各组大鼠心肌组织AMPKα1、p-AMPKα1、eNOS、p-eNOS 蛋白水平

3 讨论

2 型糖尿病是指机体内胰岛素作用减弱造成胰岛素相对缺乏的状态，从而引起体内血糖代谢紊乱。糖尿病患者通常伴随着血脂代谢异常，造成血管平滑肌及内膜引起炎症损伤，进一步引起冠状动脉粥样硬化、心肌损伤等多种心血管疾病。FAS 主要分布在肝脏及脂肪组织中，与脂肪合成密切相关的一种代谢酶，主要参与脂肪酸合成过程中转酰、缩合、还原、脱水和再还原等关键过程[10-11]。

eNOS 是调控血管内皮释放一氧化氮（NO）的关键基因，当eNOS 水平降低时，血管内皮NO 释放就会减少，导致血管内皮功能紊乱及收缩功能障碍，引起心肌细胞损伤[12]。AMPK 是体内能量代谢的关键调节激酶，在控制葡萄糖转运，脂肪酸氧化和脂质合成等过程中发挥重要作用，并能够调控eNOS 基因表达，影响NO 水平[13]。

中医学将糖尿病定义为消渴，中医理论认为糖尿病的发病机制为肝失调畅、气机不畅，痰湿不行，血液瘀滞。疏肝清热通络方是以柴胡、郁金等多种中药材组成的成方制剂，柴胡、郁金疏肝解郁，柴胡与芍药合用则调理肝气，黄芩、黄连清热泻火，当归、白芍、大黄、丹参、水蛭活血化瘀通络，全方共奏辛开苦降、调畅气机、化瘀通络功效。本研究通过观察疏肝清热通络方（SQT）对2 型糖尿病大鼠肝脏脂肪酸合成酶及心肌AMPK/eNOS 信号通路的影响，因目前临床中尚未有作用机制明确的，用于治疗糖尿病大鼠心肌损伤AMPK/ eNOS 信号通路调节剂，故本实验未使用阳性对照药物。本研究结果表明，与模型组相比，SQT 低、中、高剂量组大鼠空腹血糖及糖化血红蛋白水平明显降低，且与SQT 的剂量表现出依赖性，提示疏肝清热通络方能够呈剂量依赖性的降低大鼠血糖水平，影响大鼠体内糖代谢。血清FFA、TG、TC、LDL-C 水平是反映机体内血脂水平的关键指标，肝脏FAS mRNA水平则体现了肝脏脂肪的合成能力，间接反映了机体内血脂的代谢水平。本实验结果表明，SQT 各剂量组大鼠血清FFA、TG、TC、LDL-C 水平、肝组织FAS mRNA 水平较模型组明显降低，表明疏肝清热通络方能够通过影响糖尿病大鼠肝脏脂肪酸合成酶的表达水平，进而影响其体内活性，干扰糖尿病大鼠体内脂肪的合成，改善糖脂代谢异常。MDA 水平及SOD 活性是反映组织器官氧化应激水平的常用指标，MDA 水平升高及SOD 活性降低，均能提示机体处于氧化应激损伤状态及自我修复能力下降。本研究发现，SQT 各剂量大鼠心肌组织MDA 水平明显降低，SOD活性、AMPKα1、p-AMPKα1、eNOS及p-eNOS蛋白水平较模型组均明显升高，大鼠心肌组织病理学变化明显改善，提示疏肝清热通络方能够抑制糖尿病大鼠心肌氧化应激损伤，增强机体损伤修复能力，并改善心肌的组织病理学变化，其机制可能与激活AMPK/eNOS 信号通路有关。

综上所述，疏肝清热通络方能够明显降低2 型糖尿病大鼠血糖及血脂水平，抑制脂肪酸合成酶基因的表达，激活AMPK/eNOS 信号通路，改善大鼠心肌氧化应激水平及组织病理学变化。