加减驻景方对脉络膜新生血管动物模型缺氧信号因子表达的影响

陶方方，亢泽峰，陈水龄，褚文丽，刘健，周志豪

加减驻景方[1]是治疗年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration,AMD）和病理性近视等伴有脉络膜新生血管（choroidal neovascularization,CNV）眼底疾病的经验用方，临床治疗有效，其作用机制尚不清晰，本研究采用组织学和分子生物学技术检测CNV 动物模型中雷帕霉素靶蛋白（mammal target of rapamycin,mTOR）信号通路相关因子活性，探 讨 蛋 白 激 酶B（protein kinase B,PKB,AKT）/mTOR/缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor,HIF-1α）/血管内皮生长因子（vascular endothelium growth factor,VEGF）信号通路在CNV 形成中的作用，从而揭示加减驻景方抑制CNV 的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

8 周龄雄性SPF 级棕色挪威（brown norway，BN）大鼠138 只，体重180～220 g，购买于北京市维通利华公司。动物许可证号：SCXK（京）2012-0001。实验前，适应性饲养3 d。

1.2 试剂与仪器

PCR 仪（Biometra,TProfessional ThermoCycler），全自动荧光定量PCR 仪（7500,ABI）。SP-9000 试剂盒（中杉金桥），AKT、VEGF（Cell Signaling Technology），mTOR、HIF-1α（Abcam），cDNA 第一链合成试剂盒（Thermo Scientific,K1622）。

1.3 实验分组与给药

大鼠任一只眼为实验眼，行激光造模，每只眼光凝8～10 个点。激光功率360 mW，光斑直径50 μm，曝光时间0.05 s。按随机数字表法将造模成功的大鼠分为模型组、中药组、西药组、联合组，各30 只。

空白组：18 只大鼠，正常饲养，不做特殊处理。

模型组：光凝后第1d 予生理盐水灌胃，每日1 次，共21 d。

中药组：光凝后第1 d 予中药灌胃，每日1 次，共21 d。中药加减驻景方由楮实子、枸杞子、菟丝子、五味子、茺蔚子、三七粉、桂枝、茯苓、三棱、郁金、生黄芪和当归等多种药物组成，给药中药浓度为0.775 g/ml，灌胃量10 ml/kg。

西药组：光凝后第1 d 予玻璃体腔注射康柏西普（Conbercept），共计1 次。康柏西普，成都康鸿药业，规格10 mg/ml，微量注射器玻璃体腔注射5 μl。

联合组：光凝后第1 d 予中药灌胃（同中药组），每日1 次，共21 d，光凝后第1 d 予玻璃体腔注射康柏西普（同西药组），共计1 次。

1.4 免疫组织化学法检测AKT、mTOR、HIF-1α 和VEGF

模型组和各治疗组在光凝后第7 d、14 d、21 d各处死6 只大鼠取材。空白组在光凝后21 d 处死取材。制作组织切片，行免疫组织化学染色。石蜡切片脱蜡至水；PBS 洗涤5 min，3 次；抗原修复；3%H2O2阻断内源性过氧化物酶活性，10 min；1%Triton-100，室温1 h;试剂A，室温30 min；滴加稀释后的一抗，阴性对照用PBS 溶液代替，4°C 过夜；试剂B，室温下孵育30 min；试剂C，室温下孵育10 min；DAB 染色；自来水冲洗，苏木素复染1 min，盐酸酒精分化30 s，氨水返蓝30 s；梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，晾干；光学显微镜拍摄照片。一抗稀释倍数：AKT（1：100）；mTOR（1：200）;HIF-1α（1：200）；VEGF（1：100）。

1.5 实时荧光定量聚合酶链式反应检测AKT、mTOR、HIF-1α 和VEGF 的mRNA 表达

采用实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）技术，光凝后21 d，每组各处死6 只大鼠获取眼杯，参照试剂盒方法用Trizol 一步法裂解组织，提取总RNA，按照试剂盒说明书，合成cDNA。配制反应体系如下：RealMasterMix 和SYBR 混合物10μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，cDNA 1 μl，超纯水定容至20 μl，进行PCR 循环，95℃预变性10 min；95℃变性20 s、60℃退火30 s、68℃延伸60 s；循环40 次。引物由北京科悦达生物科技有限公司合成（表1）。

1.6 蛋白免疫印迹技术检测目的蛋白表达

采用蛋白免疫印迹（western blotting）技术检测目的蛋白表达，光凝后21 d，每组各处死6 只大鼠获取眼杯，获取蛋白质样品，测定总蛋白浓度，SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，起始电压设定为80 V，当样品进入分离胶时，调整电压至120 V，继续电泳，直至溴酚蓝跑至底部时，结束电泳。转膜；5%脱脂牛奶封闭，室温摇床孵育2 h；一抗4℃孵育过夜；1：5000 稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，室温孵育1 h；显影液显影。

1.7 图像分析方法

每组选取15 张包含CNV 的免疫组化图像，Image Pro Plus 6.0 软件分析图像的平均光密度值（average optical density,AOD）值作为半定量测定阳性表达物的依据。用空白组目的基因与内参GAPDH的相对表达量进行校正，得到空白组目的基因mRNA 相对表达量为1 时，实验组目的基因mRNA 表达量是空白组的倍数。将“2-ΔΔCt”视为各目的基因mRNA 的相对表达量。使用Quantity One 分析软件测定条带光密度值，以GAPDH 条带的光密度值校正，目的蛋白的相对表达量以目的基因条带的光密度值与GAPDH 条带的光密度值之比来表示。

1.8 统计学方法

采用统计学软件SPSS 21.0 进行数据分析。计量资料以平均数±标准差（）描述，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用方差分析中LSD-t检验。当P＜0.05 时，则认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化结果

2.1.1 AKT 空白组大鼠视网膜组织中可见AKT 表达，视网膜神经节细胞层可见阳性反应物。模型组和各治疗组视网膜光凝区CNV 组织中AKT 表达均呈强阳性，CNV 组织中可见大量黄棕色阳性反应物。模型组和联合组AKT 表达量在光凝后7 d 时最大，21 d时缓慢减少（P＜0.05）；中药组和西药组AKT 表达量在光凝后14 d 时最大，21 d 时显著减少（P＜0.05）。

光凝后7 d，各治疗组AKT 表达量均低于模型组，中药组AKT 表达量高于西药组与联合组（P＜0.05），西药组与联合组无明显差异（P＞0.05）。光凝后14 d 与21 d，各治疗组AKT 表达量均低于模型组，联合组AKT 表达量最低，西药组次之，西药组AKT 表达量低于中药组（P＜0.05）（表2，图1）。

2.1.2 mTOR 空白组BN 大鼠视网膜组织中可见mTOR 表达，视网膜神经节细胞层可见少量阳性反应物。模型组和各治疗组CNV 组织中mTOR 呈强阳性表达，CNV 组织中可见大量黄棕色阳性反应物。模型组、中药组和联合组mTOR 表达量在光凝后7 d 时最大，21 d 时显著减少（P＜0.05）。西药组mTOR 表达量在光凝后14 d 时最大，21 d 时显著减少（P＜0.05）。

表1 RT-qPCR 引物序列

表2 光凝后不同时间各组AKT 的AOD 值变化（，n=15）

表2 光凝后不同时间各组AKT 的AOD 值变化（，n=15）

注：※ 与同时间段模型组比较，P＜0.05；# 与同时间段中药组比较，P＜0.05；&与同时间段西药组比较，P＜0.05；* 与同时间段联合组比较，P＜0.05

光凝后7 d，西药组与联合组mTOR 表达量均低于模型组和中药组（P＜0.05），中药组与模型组无明显差异（P＞0.05）。光凝后14 d 与21 d，各治疗组mTOR 表达量均低于模型组，联合组mTOR 表达量最低，西药组次之，西药组mTOR 表达量低于中药组（表3，图2）。

表3 光凝后不同时间各组mTOR 的AOD 值变化（，n=15）

表3 光凝后不同时间各组mTOR 的AOD 值变化（，n=15）

注：※ 与同时间段模型组比较，P＜0.05；# 与同时间段中药组比较，P＜0.05；&与同时间段西药组比较，P＜0.05；* 与同时间段联合组比较，P＜0.05

图1 AKT 免疫组化图像（DAB 染色，×400）。1A 空白组，正常BN 大鼠视网膜组织中AKT 呈阳性表达。1B 7 d 模型组；1C 7 d 中药组；1D 21 d 中药组；1E 7 d 西药组；1F 21 d 西药组；1G 7 d 联合组；1H 21 d 联合组。模型组和各治疗组CNV 中AKT 呈强阳性表达

图2 mTOR 免疫组化图像（DAB 染色，×400）。2A 空白组，正常BN 大鼠视网膜组织中mTOR 呈阳性表达；2B 7 d 模型组；2C 7 d 中药组；2D 21 d 中药组；2E 7 d 西药组；2F 21 d 西药组；2G 7 d 联合组；2H 21 d 联合组。模型组和各治疗组CNV 中mTOR 呈阳性表达

2.1.3 HIF-1α 空白组BN 大鼠视网膜组织中可见HIF-1α 表达，视网膜神经节细胞层可见阳性反应物。模型组和各治疗组CNV 组织中HIF-1α 呈阳性表达，CNV 组织中可见大量黄棕色阳性反应物。模型组、中药组和联合组HIF-1α 表达量在光凝后14 d时最大，21 d 时显著减少（P＜0.05）。西药组HIF-1α表达量在光凝后不同时间无明显变化（P＞0.05）。

光凝后7 d，西药组与联合组HIF-1α 表达量均低于模型组和中药组（P＜0.05），中药组与模型组无明显差异（P＞0.05）。光凝后14 d，各治疗组HIF-1α表达量均低于模型组，西药组HIF-1α 表达量最低，联合组次之，联合组HIF-1α 表达量低于中药组（P＜0.05）。光凝后21 d，各治疗组HIF-1α 表达量均低于模型组，联合组HIF-1α 表达量最低，西药组次之，西药组HIF-1α 表达量低于中药组（P＜0.05）（表4，图3）。

表4 光凝后不同时间各组HIF-1α 的AOD 值变化（，n=15）

表4 光凝后不同时间各组HIF-1α 的AOD 值变化（，n=15）

注：※ 与同时间段模型组比较，P＜0.05；# 与同时间段中药组比较，P＜0.05；&与同时间段西药组比较，P＜0.05；* 与同时间段联合组比较，P＜0.05

2.1.4 VEGF 空白组BN 大鼠视网膜组织中可见VEGF 表达，视网膜神经节细胞层可见少量阳性反应物。模型组和各治疗组CNV 组织中VEGF 呈阳性表达，CNV 组织中可见大量黄棕色阳性反应物。模型组和中药组VEGF 表达量在光凝后7 d 时最大，随后逐渐减少（P＜0.05）。西药组VEGF 表达量在光凝后7 d 时最大，21 d 时显著减少（P＜0.05）。联合组VEGF 表达量在光凝后7 d 时最大，14 d 时显著减少，21 d 较14 d 有明显增加（P＜0.05）。

光凝后7d、14d 与21d，各治疗组VEGF 表达量均低于模型组，联合组VEGF 表达量最低，西药组次之，西药组VEGF 表达量低于中药组（P＜0.05）（表5，图4）。

表5 光凝后不同时间各组VEGF 的AOD 值变化（，n=15）

表5 光凝后不同时间各组VEGF 的AOD 值变化（，n=15）

注：※ 与同时间段模型组比较，P＜0.05；# 与同时间段中药组比较，P＜0.05；&与同时间段西药组比较，P＜0.05；* 与同时间段联合组比较，P＜0.05

2.2 RT-qPCR 检测mRNA 相对表达量

模型组与治疗组各目的基因mRNA 相对表达量较空白组均有明显增多（P＜0.05）。除mTOR 以外，各治疗组目的基因mRNA 相对表达量均低于模型组（P＜0.05），中药组mTOR mRNA 相对表达量与模型组无明显差异（P＞0.05）。各治疗组AKT、mTOR 和VEGF mRNA 相对表达量由高到低依次为中药组、西药组和联合组（P＜0.05）。中药组HIF-1α mRNA相对表达量高于西药组和联合组（P＜0.05），西药组和联合组之间无明显差异（P＞0.05）（表6）。

图3 HIF-1α 免疫组化图像（DAB 染色，×400）。3A 空白组，正常BN 大鼠视网膜组织中HIF-1α 呈阳性表达；3B 7 d 模型组；3C 7 d 中药组；3D 21 d 中药组；3E 7 d 西药组；3F 21 d 西药组；3G 7 d 联合组；3H 21 d 联合组。模型组和各治疗组CNV 中HIF-1α 呈阳性表达

图4 VEGF 免疫组化图像（DAB 染色，×400）。4A 空白组，正常BN 大鼠视网膜组织中VEGF 呈阳性表达；4B 7 d 模型组；4C 7 d 中药组；4D 21 d 中药组；4E 7 d 西药组；4F 21 d 西药组；4G 7 d 联合组；4H 21 d 联合组。模型组和各治疗组CNV 中VEGF 呈阳性表达

表6 AKT、mTOR、HIF-1α 与VEGF mRNA 相对表达量δ（，n=9）

表6 AKT、mTOR、HIF-1α 与VEGF mRNA 相对表达量δ（，n=9）

注：δ 空白组设为1，其他组与其相除获得相对值；※ 与模型组比较，P＜0.05；# 与中药组比较，P＜0.05；&与西药组比较，P＜0.05；* 与联合组比较，P＜0.05

2.3 Western blotting 检测蛋白相对表达量

模型组和治疗组各目的蛋白相对表达量较空白组均有明显增多（P＜0.05）。模型组、中药组AKT 蛋白相对表达量较西药组、联合组高（P＜0.05）。除AKT蛋白以外，各治疗组目的蛋白相对表达量均低于模型组（P＜0.05）。各治疗组mTOR 与VEGF 蛋白相对表达量由高到低依次为中药组、西药组和联合组（P＜0.05）。HIF-1α 蛋白相对表达量中药组较高（P＜0.05），西药组与联合组无明显差异（P＞0.05）（表7，图5）。

表7 AKT、mTOR、HIF-1α 与VEGF 蛋白相对表达量δ（，n=9）

表7 AKT、mTOR、HIF-1α 与VEGF 蛋白相对表达量δ（，n=9）

注：δ 内参GAPDH 设为1，其他组与其相除获得相对值；Δ 与空白组比较，P＜0.05；※ 与模型组比较，P＜0.05；# 与中药组比较，P＜0.05；&与西药组比较，P＜0.05；* 与联合组比较，P＜0.05

图5 Western blotting 图像。1～5 依次为空白组、模型组、中药组、西药组和联合组

3 讨论

CNV 是AMD、病理性近视等多种严重损害视功能眼病的共同病理产物，其病因尚不十分明确，治疗棘手。CNV 的形成与VEGF、白细胞介素-6 等多种细胞因子的作用有关，其中AKT/mTOR/HIF-1α是调控VEGF 表达的主要信号通路之一[2]。

VEGF 是目前已知促进CNV 生成最关键的因子，VEGF-A 是最重要的家族成员，以往称为VEGF，主要高表达于有新生血管的组织与细胞中，如肿瘤组织、缺血缺氧性眼病组织、胎儿组织等，而在正常人与动物组织中低表达。VEGF-A 不仅可以有选择的促进血管内皮细胞的有丝分裂、移行，诱导毛细血管形成来促进新生血管的生成[3]，还可以增加微小血管通透性，促进细胞外基质形成，为新生血管的形成提供营养[4]，促进血管形成。

PI3K/AKT/mTOR 信号通路是内皮细胞中调控HIF-1α mRNA 翻译的关键信号通路[5-6]，生长因子、缺氧等因素可以激活PI3K/AKT/mTOR 信号通路[7]，促使HIF-1α 蛋白表达的上调，HIF-1 与靶基因的缺氧反应元件结合，如VEGF，从而激活VEGF mRNA 的转录[2,8-10]，进而激活VEGF 的表达，使内皮细胞迁移促进CNV 的形成。本研究中，模型组表达的AKT、mTOR、HIF-1α、VEGF 蛋白及mRNA 较空 白组均有显著增强。氪激光诱导的BN 大鼠CNV 模型中，AKT/mTOR/HIF-1α/VEGF 信号通路的激活促进了CNV 的生成。

加减驻景方是亢泽峰教授治疗AMD 和病理性近视等伴有CNV 眼底疾病的经验用方，亢教授将AMD 归为中医眼科“瞳神络病”的范畴[11-12]。清代名医叶天士[13]有言：“久病必治络—病久气血推行不利，血络之中必有瘀凝，故致病气缠延不去，必疏其络而病气可尽也”。王清任[14]认为：“元气既虚，必不能达于血管，血管无气，必停留而瘀”。亢教授认为，本病病机主要为肝肾不足，兼具气血津液功能障碍，表现为瘀、痰、湿的本虚标实证，治以补肾明目、活血通络为要则，辅以利水渗湿、止血活血、益气养血、温阳通络之药。因此，组成了以“补肾明目、益气活血、化瘀通络”为治则的加减驻景方。

方中菟丝子补肾益精，养肝明目，为平补阴阳之品，善滋补肝肾、益精养血而明目，《神农本草经》[15]言：“久服明目”。枸杞子，为平补肾精肝血之品，与菟丝子合用，常用于肝肾阴虚之内障目昏，共为君药。五味子酸咸，敛肺金滋肾水；楮实子，益精强阴；黄芪甘温，益气健脾补中，伍以甘温之当归，凑健脾益气补血之效，目得血而能视；以上共助君药补益肝肾、益气养血明目而为臣。三七，活血通窍。郁金，活血行气，通利玄府清窍，又制臣药之温燥。三棱，破血行气，《神农本草经疏》[16]曰：“从血药则治血，从气药则治气”，三者相合，散瘀行气之力著。茯苓，渗湿健脾，消痰利水。合芪、归，能补益心脾，使血行畅通、生血有源，又可防诸药滋腻，合于桂枝，温通血脉，化气利水，共达行瘀利水之效。以上共为佐药，减君臣药之滋腻，又奏气滞血瘀之效，使水行、络脉通，减轻痰湿、血瘀等“邪阻”之证。加减驻景方中多种药物具有耐缺氧、增加血流量、降低血管阻力、抑制VEGF表达等作用。如菟丝子具有增加冠状动脉血流量与降低血管阻力作用[17]，枸杞多糖有耐缺氧作用[18]，三棱含药血清有抑制血管内皮细胞表达VEGF 的作用[19]。

本研究中，各治疗组均有抑制AKT/mTOR/HIF-1α/VEGF 信号通路活性的作用。西药组与联合组对AKT/mTOR/HIF-1α/VEGF 信号通路活性的抑制作用强于中药组，加减驻景方通过降低AKT/mTOR/HIF-1α/VEGF 信号通路活性，发挥了抑制CNV 形成的作用，这可能与方药中多种药物耐缺氧、增加冠状动脉血流量、抑制VEGF 表达的作用有关。