miR-4286靶向FOXO4对肺癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响①

赵 敏 厉永强 石贞玉（河南大学淮河医院呼吸与危重症医学科，开封 475000）

肺癌是恶性肿瘤中发病率和死亡率增长最快的疾病之一，更是全球癌症相关死亡的最主要原因，对人类的健康和生命构成严重威胁［1］。由于肺癌起病隐匿，确诊时多为中晚期，且手术、放化疗后易复发和转移，缩短了患者的生存期。因此，寻找有效的诊疗靶点抑制肺癌的转移是目前肺癌治疗的重大课题。微小RNA（microRNA，miRNA）是长度为20～25个核苷酸的内源性非编码小RNA，其通过与靶基因的3′非翻译区（untranslated region，UTR）结合调节细胞的存活、增殖、凋亡、侵袭和转移［2］。大量研究证实，在包括肺癌在内的多种恶性肿瘤中，miRNA发挥抑癌基因或致癌基因作用［3-4］。miR-4286位于人染色体8p23.1位点，已经证实可参与调节黑色素瘤、食管鳞癌和胰腺癌进程［5-7］。在肺癌细胞中，miR-4286呈高表达，其高表达与肿瘤大小、淋巴结转移及TNM分期相关［8］。然而，miR-4286在肺癌进展中的作用机制并未完全阐明。生物信息学分析显示叉头样转录因子O4（forkhead box O4，FOXO4）可能是miR-4286的靶基因，作为一种转录抑制因子，研究显示肺癌中FOXO4表达显著降低，抑制其表达可促进肺癌转移［9-10］。但miR-4286能否靶向FOXO4参与肺癌进展尚未明确。本研究旨在揭示miR-4286和FOXO4在肺癌细胞生长、转移和凋亡中的作用，为miR-4286在肺癌临床生物治疗中的应用提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 组织来源 选择我院收治的肺癌患者29例，其中男性17例，女性12例；年龄40～75岁。分别取其肺癌组织及与其对应的癌旁组织，手术切除后立即放入液氮中保存，随后放入-80℃冰箱保存备用。所有病例术前均未接受化疗或放疗。所有患者均签署知情同意书，且经本院伦理委员会批准。

1.1.2 细胞株和主要试剂 肺癌细胞A549购于中国科学院上海细胞研究所；DMEM培养液、胎牛血清购于美国Hyclone公司；逆转录试剂盒、SYBR Pre‑mix Ex TaqⅡ试剂盒购于大连宝生物工程有限公司；miRNA抑制物阴性对照（anti-miR-NC）、miR-4286抑制物（anti-miR-4286）、小干扰RNA阴性对照（si-NC）、FOXO4小干扰RNA（si-FOXO4）购于上海生工生物工程有限公司；细胞计数试剂盒（cell counting kit 8，CCK-8）、膜联蛋白V异硫氰光素荧光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）双染细胞凋亡检测试剂盒购于杭州贝博生物公司；Transwell小室和基质胶购于美国Cornning公司；兔源FOXO4、P21、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase-3）、上皮细胞钙黏蛋白（E-cadherin）、基质金属蛋白酶2（matrix me‑talloproteinase 2，MMP-2）和磷酸甘油醛脱氢酶（glyc‑eraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体购于美国Abcam公司；山羊抗兔二抗购于北京中山金桥生物科技有限公司。实验引物由上海生工生物工程有限公司提供。FOXO4上游引物5′-CCGGCAAAAGCTCTTGGTG-3′，下 游 引 物5′-GGTCCACATATCGGCTTCTTCA-3′；GAPDH上游引物5′-TG‑GTGAAGACGCCAGTGGA-3′，下游引物5′-GCACC‑GTCAAGGCTGAGAAC-3′；miR-4286上游引物5′-ACACTCCAGCTGGGACCCCACTCCT-3′，下游引物5′-TACCAGGAGTGGGGTTT-3′；U6上 游 引 物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AAGGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR检 测miR-4286和FOXO4 mRNA的表达Trizol法检测肺癌组织、癌旁组织中总RNA，将提取的总RNA溶解于RNase-free水，紫外分光光度计检测RNA浓度和纯度。根据逆转录试剂盒说明书将RNA逆转为cDNA后，按照SYBR Pre‑mix Ex TaqⅡ试剂盒说明书对miR-4286和FOXO4进行PCR扩增。miR-4286的检测以U6为内参，FOXO4 mRNA的检测以GAPDH为内参。2-ΔΔCt法计算miR-4286和FOXO4 mRNA的相对表达水平。

1.2.2 细胞培养和实验分组 将A549细胞分为anti-miR-NC组（转染anti-miR-NC）和anti-miR-4286组（转染anti-miR-4286）。采用含10%胎牛血清的DMEM培养液于37℃、5%CO2的培养箱中培养肺癌A549细胞。转染前1 d，将A549细胞以2×105个/孔的密度接种于6孔板，按照脂质体LipofectamineTM2000说明书将anti-miR-NC、anti-miR-4286分别转染至A549细胞，转染48 h，检测转染效果合格后进行其他指标检测。为证实miR-4286是通过调控FOXO4进而影响A549细胞的增殖、迁移侵袭能力和凋亡，将A549细胞分为anti-miR-4286+si-NC组（共转染anti-miR-4286和si-NC）和anti-miR-4286+si-FOXO4组（共转染anti-miR-4286和si-FOXO4），转染48 h检测转染效果合格后检测细胞的增殖、迁移侵袭能力及凋亡变化。

1.2.3 CCK-8法检测细胞存活 将1×104个A549细胞接种于96孔板，根据实验分组进行细胞转染，培养箱孵育48 h，向各孔内加入10µl CCK-8试剂，继续孵育2 h，酶标仪检测450 nm处各孔的吸光度值，计算细胞存活率。细胞存活率=（实验组OD-空白组OD）/（对照组OD-空白组OD）。

1.2.4 克隆形成实验检测细胞克隆形成能力 收集转染48 h的anti-miR-NC组、anti-miR-4286组、an‑ti-miR-4286+si-NC组 和anti-miR-4286+si-FOXO4组A549细胞，胰酶消化后，取2×103个细胞均匀分散铺于6孔板，细胞培养箱常规培养7 d，当出现肉眼可见的集落时，弃去培养基，PBS缓冲液洗涤细胞1次，依次加入多聚甲醛和结晶紫染液进行固定和染色，PBS缓冲液冲洗3次，常温晾干后，显微镜下统计大于50个细胞的集落数。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 收集转染48 h的anti-miR-NC组、anti-miR-4286组、anti-miR-4286+si-NC组和anti-miR-4286+si-FOXO4组A549细胞，胰酶消化后，PBS洗涤细胞2次，离心后加入适量结合缓冲液制备细胞浓度为1×106个/ml的单细胞悬液。取100µl细胞悬液加入流式管，按照Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒分别加入5µl Annexin V-FITC和5µl PI，避光孵育15 min，补加结合缓冲液至500µl，混匀后1 h上机检测各组A549细胞凋亡情况。

1.2.6 Transwell实验检测细胞迁移和侵袭 侵袭实验：将基质胶均匀平铺于Transwell小室上室膜，备用。细胞转染48 h消化后，采用无血清培养基制备单细胞悬液。取200µl接种于Transwell上室，24孔板下室仅加入500µl含20%胎牛血清的细胞培养基，将含有Transwell小室的24孔板置于培养箱常规培养24 h，取出Transwell小室，轻轻擦去上室膜未过膜细胞后，依次采用多聚甲醛、结晶紫进行固定和染色，将Transwell小室倒置于显微镜下观察细胞过膜情况，随机选取5个视野进行计数和拍照，以其均值表示侵袭细胞数目。迁移实验采用未包被基质胶的Transwell小室，其他步骤同上。

1.2.7 Western blot检测FOXO4、P21、Caspase-3、Ecadherin和MMP-2蛋白的表达 采用RIPA分别提取anti-miR-NC组、anti-miR-4286组、anti-miR-4286+si-NC组 和anti-miR-4286+si-FOXO4组A549细 胞 的总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度。沸水浴3 min变性细胞蛋白，配制浓缩胶和分离胶，以每泳道30µg蛋白样品上样，随后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。结束后，常规湿法将分离细胞蛋白转移至硝酸纤维素膜。将膜置于5%的牛血清蛋白溶液中室温条件封闭1 h，洗膜后，将膜置于稀释的一抗溶液室温孵育2 h，洗膜，将膜置于稀释的二抗溶液中室温孵育1 h，洗膜后，于暗室进行化学发光盒显色。以GAPDH为内参，采用Image J分析软件分析各条带的灰度值，以目的蛋白灰度值和GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白相对表达量。

1.2.8 双荧光素酶报告基因实验验证miR-4286和FOXO4的靶向关系 采用TargetScan在线分析软件预测miR-4286的靶基因，发现FOXO4是miR-4286的潜在功能性靶基因之一，推测miR-4286能靶向调控FOXO4表达，并进行双荧光素酶报告基因实验验证。构建含有FOXO4-3′UTR序列的野生型荧光素酶报告质粒（WT-FOXO4）及含有FOXO4-3′-UTR突变序列的突变型荧光素酶报告质粒（MUT-FOXO4），质粒构建由上海吉玛公司完成。将A549细胞接种至6孔板，利用细胞转染试剂LipofectamineTM2000将WT-FOXO4、MUT-FOXO4分别与miR-NC、miR-4286 mimics共转染至A549细胞，6 h后更换为完全细胞培养液，培养48 h后检测各组细胞荧光素酶活性变化。为验证miR-4286对FOXO4的调控作用，以miR-NC、miR-4286 mimics、anti-miR-NC、anti-miR-4286分别转染A549细胞，转染48 h裂解细胞按照Western blot步骤检测FOXO4蛋白的表达变化。

2 结果

2.1 miR-4286、FOXO4在肺癌组织和癌旁组织中的表达RT-qPCR检测肺癌组织和癌旁组织中miR-4286和FOXO4 mRNA的表达，结果显示，肺癌组织中miR-4286的表达较癌旁组织显著升高，FOXO4 mRNA的表达较癌旁组织显著降低（P＜0.05）。见表1。

表1 miR-4286、FOXO4在肺癌组织和癌旁组织中的表达（±s）Tab.1 Expressions of miR-4286 and FOXO4 in lung can-cer and paracancerous tissues（±s）

表1 miR-4286、FOXO4在肺癌组织和癌旁组织中的表达（±s）Tab.1 Expressions of miR-4286 and FOXO4 in lung can-cer and paracancerous tissues（±s）

Note：1）P＜0.05，compared with paracancerous tissue group.

FOXO4 mRNA 1.01±0.10 0.22±0.021）41.717＜0.001 Groups Paracancerous tissue Lung cancer tissue n 29 29 t P miR-4286 0.99±0.10 2.35±0.211）31.488＜0.001

2.2 抑制miR-4286对肺癌细胞增殖、凋亡的影响见图1，转染anti-miR-4286抑制miR-4286表达后，A549细胞中P21和Caspase-3蛋白表达显著升高，细胞存活率从（100.12±10.06）%降为（47.95±4.68）%，克隆形成数从162±15.31降为76±7.15，细胞凋亡率从（7.65±0.83）%升高为（23.21±2.26）%（P＜0.05）。

图1 抑制miR-4286对肺癌细胞增殖、凋亡的影响Fig.1 Effect of inhibiting miR-4286 on proliferation and apoptosis of lung cancer cells

2.3 抑制miR-4286对肺癌细胞迁移、侵袭的影响 见图2，转染anti-miR-4286抑制miR-4286表达后，A549细胞E-cadherin蛋白表达显著增加，MMP-2蛋白的表达显著降低，迁移和侵袭细胞数显著降低（P＜0.05）。

图2 抑制miR-4286对肺癌细胞迁移、侵袭及E-cadherin、MMP-2蛋白表达的影响Fig.2 Effect of inhibiting miR-4286 on lung cancer cell migration，invasion，and expression of E-cadherin and MMP-2 proteins

2.4 miR-4286靶向、调控FOXO4表达TargetScan预测miR-4286的靶基因结果显示，miR-4286和FOXO4的3′-UTR区域存在部分连续互补的核苷酸序列，见图3A。双荧光素酶报告实验验证miR-4286和FOXO4的靶向关系发现，上调miR-4286表达可降低转染WT-FOXO4的A549细胞的荧光素酶活性（P＜0.05）；而上调miR-4286表达对转染MUTFOXO4的A549细胞的荧光素酶活性无显著影响（图3B），Western blot结果显示上调miR-4286表达后A549细胞FOXO4在mRNA和蛋白水平的表达显著降低；抑制miR-4286表达后A549细胞FOXO4蛋白的表达水平显著升高（P＜0.05），见图3C。

图3 miR-4286靶向调控FOXO4Fig.3 miR-4286 targets regulated FOXO4

2.5 抑制FOXO4能逆转抑制miR-4286对肺癌细胞增殖、凋亡的作用 见图4，与anti-miR-4286和si-NC共转染组比较，anti-miR-4286和si-FOXO4共转染组A549细胞FOXO4、P21和Caspase-3蛋白表达显著降低，细胞存活率从（48.23±4.61）%升高为（86.91±8.58）%，克隆形成数从77±7.15升高为137±12.94，细胞凋亡率从（23.11±2.18）%降为（11.34±1.26）%（P＜0.05）。抑制FOXO4表达可逆转抑制miR-4286对肺癌细胞增殖和凋亡的影响。

图4 抑制FOXO4能逆转抑制miR-4286对肺癌细胞增殖、凋亡的影响Fig.4 Inhibiting FOXO4 can reverse effects of inhibition of miR-4286 on lung cancer cell proliferation and apoptosis

2.6 抑制FOXO4能逆转抑制miR-4286对肺癌细胞迁移、侵袭的作用 见图5，与anti-miR-4286和si-NC共转染组比较，anti-miR-4286和si-FOXO4共转染组A549细胞E-cadherin蛋白表达显著降低，MMP-2蛋白表达显著升高，迁移和侵袭细胞数显著增加（P＜0.05）。提示抑制FOXO4表达可逆转抑制miR-4286对肺癌细胞增殖和凋亡的影响。

图5 抑制FOXO4能逆转抑制miR-4286肺癌细胞迁移、侵袭及E-cadherin、MMP-2蛋白表达的影响Fig.5 Inhibiting FOXO4 can reverse effects of inhibiting miR-4286 on lung cancer cell migration，invasion，and E-cadherin，MMP-2 protein expression

3 讨论

肿瘤转移是一个多步骤、多基因参与，并受精确调控的过程。阐明肺癌发生转移的分子机制，寻找有效抑制肺癌转移的靶基因对肺癌患者的精准治疗意义重大。

miR-4286已被证实是肿瘤进展的重要参与者。KOMINA等［5］研究发现黑色素瘤中miR-4286表达显著增加，转染miR-4286抑制剂后黑色素瘤细胞凋亡率增加2.6倍，细胞增殖活力下降1.7倍。LI等［11］指出miR-4286在前列腺癌中呈高表达，下调miR-4286可抑制前列腺癌细胞增殖，诱导细胞凋亡。ZHANG等［6］研究表明，miR-4286高表达通过激活蛋白酪氨酸激酶2/信号转导子与激活子3（JAK2/STAT3）信号通路显著增加细胞活力以及迁移、侵袭能力，促进食管癌发生发展。本研究显示，肺癌组织中miR-4286表达显著升高，抑制miR-4286可促进A549细胞P21和Caspase-3蛋白表达，降低细胞增殖、迁移侵袭能力，诱导细胞凋亡。黏附和侵袭在肿瘤转移中起重要作用，E-cadherin是一种典型的钙黏蛋白，其下调导致上皮细胞特征的丧失和间充质表型的获得，从而促进细胞增殖、运动和侵袭，并可能导致癌症进展［12］。MMP-2是破坏是肿瘤侵袭屏障的关键蛋白酶，其表达增加与肿瘤的转移潜能增加有关［13］。因此，抑制miR-4286可能通过抑制A549细胞MMP-2表达，促进E-cadherin表达，进而发挥抗肺癌转移作用。既往研究显示，miR-4286过表达在肺癌细胞中具有肿瘤启动子作用，抑制miR-4286表达除可抑制细胞活力、增殖和迁移以及促进细胞凋亡外，还可诱导细胞周期G1期阻滞，与本研究类似［14-15］。以上研究表明，miR-4286在肺癌中发挥癌基因作用，抑制miR-4286可有效抑制肺癌进展。

FOX转录因子是一个大的进化保守的转录调控家族，具有高度保守的双翼螺旋DNA结合域。研究显示FOXO4具有诱导细胞周期阻滞、凋亡和DNA损伤修复的功能，是人类肿瘤的理想抑癌因子［16］。FOXO4表达缺失是膀胱癌预后不良的危险因素［17］。在结肠癌和胃癌中上调FOXO4可抑制肿瘤细胞的增殖和迁移［18-19］。在肺癌中FOXO4表达缺失是上皮间质转化发生的重要原因之一，miR-150通过靶向FOXO4促肺癌转移［20］。本研究显示肺癌组织中FOXO4表达显著降低，与miR-4286的表达呈负相关。荧光素酶报告基因实验显示，FOXO4是miR-4286的功能性靶基因。外源性miR-4286模拟物或抑制物转染A549细胞可分别抑制或促进FOXO4蛋白表达。进一步研究显示抑制FOXO4表达可逆转抑制miR-4286对A549细胞增殖、迁移侵袭及凋亡的影响。提示miR-4286/FOXO4分子轴参与肺癌发生发展。

综上所述，本研究发现miR-4286/FOXO4分子轴在肺癌中表达失调。抑制miR-4286通过上调FOXO4抑制肺癌细胞增殖、迁移、侵袭，并诱导细胞凋亡。因此，靶向抑制miR-4286可能是转移性肺癌的潜在治疗策略。