抑制HMGB1对心肌梗死大鼠模型心肌纤维化的影响及机制研究①

张 妍 田立群 冯 莹 张盈盈 王代宗 易春峰（武汉市第一医院心内科，武汉 430022）

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是心肌衰竭的主要病因之一，MI后心肌组织由于长时间缺血、缺氧导致损伤甚至死亡，目前，MI是全球高发病率和高死亡率的疾病之一［1］。缺血所致MI的标准治疗方法为再灌注，但缺血后再灌注对心肌组织具有一定损伤［2］。心肌缺血后心脏会进行心室重塑，细胞外胶原基质不断沉积，成纤维细胞增殖，导致心肌细胞肥大、心肌纤维化及细胞凋亡［3］。坏死的心肌细胞在缺血环境中被动释放高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1），研究表明，HMGB1是心肌缺血再灌注（myocardial ischemia and reperfusion，I/R）后炎症反应的早期介质，而炎症反应可促进心肌纤维化［4-5］。本研究拟通过阻断HMGB1探讨其对MI引起的心肌纤维化的保护作用及机制，以期为治疗MI引起的心肌纤维化提供新靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雄性SD大鼠15只，体重250～300 g，由华中农业大学实验中心提供，合格证号：42000600032585，设施使用证号：00276883。

1.1.2 试剂HMGB1抑制剂glycyrrhizin购自MEC；戊巴比妥钠麻醉剂购自Sigma merck；Ⅰ型胶原蛋白（collagenⅠ，COL-Ⅰ）抗体和转化生长因子β 1（transforming growth factor beta1，TGF-β1）抗体购自Abcam；MaxVisionTMHRP-Polymer anti-Mouse/Rab‑bit IHC Kit二抗购自迈新；DAB染色试剂盒、HMGB1抗体、基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）抗体、Toll样受体4（toll-like receptors，TLR4）抗体、p-NF-κB抗体、NF-κB、GAPDH抗体和Goat Anti-Rabbit IgG抗体购自武汉Bioswamp。

1.1.3 仪器Bw-bm1103小动物呼吸机（上海软隆科技发展有限公司）；SZM45-STL1体视显微镜（舜宇光学科技有限公司）；IMAC300VET心电图仪（武汉中旗）；DM1000正置显微镜（徕卡显微系统有限公司）；mini protean 3 cell电泳仪（BIO-RAD）；MK3酶标仪（芬兰雷勃）；Tanon-5200全自动化学发光分析仪（上海天能）。

1.2 方法

1.2.1 造模及分组15只大鼠随机分为正常组、模型组和HMGB1抑制组，每组5只。正常组大鼠不做任何处理，模型组和HMGB1抑制组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠（30 mg/kg）进行麻醉，呼吸机辅助呼吸通过气管插管进行，呼吸频率调节至50次/min，潮气量20 ml/kg，采用肢体皮下插入针电极方式沿胸骨左缘开胸，于3、4肋间行纵向切口，剪断肋骨，破胸膜、心包膜，在左冠状动脉前降支起始部采用6-0针线穿过心肌浅层，穿入直径为2 mm的聚乙烯管，稳定1 min后抽紧丝线，阻断冠脉血流。缺血处理30 min后松开丝线与聚乙烯管，恢复血流灌注。HMGB1抑制组于IR前5 min进行第1次给药，静脉注射HMGB1抑制剂［10 mg/（kg·d）］，每24 h给药1次，连续给药21 d，模型组静脉注射等量生理盐水［6］。

1.2.2 HE染色观察心肌组织病理情况 将脱水完成的样本进行石蜡包埋和石蜡切片，60℃烘干，常规脱蜡至水，水洗3～5 min，苏木素染色3～5 min，0.5%盐酸分化液分化数秒，水洗后返蓝液返蓝，流水洗去返蓝液，伊红染色5 min，流水冲洗数秒，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察。

1.2.3 Masson染色观察心肌组织纤维化程度 石蜡切片常规脱蜡至水后流水冲洗1～3 min，配制苏木素染色液和三氯化铁水溶液等量混合溶液，滴加至有组织切片染色5 min，盐酸乙醇分化液分化、水洗，返蓝，水洗，蒸馏水洗1 min，酸性品红染色5～10 min，乙酸水溶液洗1 min，磷钼酸水溶液洗1～2 min，乙酸水溶液洗1 min，苯胺蓝染色液染色1～2 min，乙酸水溶液洗1 min，梯度乙醇快速脱水，二甲苯透明3次，1～2 min/次，中性树胶封固，显微镜下观察，自动图像分析仪定量测定间质胶原含量。

1.2.4 Western blot检测COL-Ⅰ、MMP2、TGF-β1、HMGB1、TLR4、p-NF-κB/NF-κB表达 提取蛋白后进行蛋白定量，同时配制SDS-PAGE胶，上样，以浓缩胶80 V 40 min，分离胶120 V 50 min进行电泳，染料到达底部时终止电泳，转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，按照说明书稀释一抗，4℃孵育过夜。孵育一抗的膜用PBST洗3次，5 min/次，稀释HRP标记的二抗（1：10 000），室温孵育1 h，PBST洗3次，5 min/次，暗室中将ECL发光液A和B等量混匀，加在膜的正面与之充分接触，全自动化学发光分析仪中检测，TANON GIS软件读取相关条带灰度值。

1.3 统计学处理 采用SPSS18.0软件进行统计学处理，数据以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MI模型鉴定 模型构建时大鼠aVF导联心电图见图1，与正常组相比，ST段明显抬高，提示造模成功。

图1 大鼠Ⅱ导联心电图观察Fig.1 Observation of Ⅱlead electrocardiagram

2.2 HMGB1抑制对MI大鼠病理形态的影响HE染色结果显示，正常组大鼠心肌组织未见明显病理变化，心肌组织结构清晰，心肌纤维排列整齐，结果完整，心肌纤维极少断裂，心肌细胞间质未见水肿。模型组大鼠心肌组织呈纤维化，细胞核不规则，呈浓缩状，有炎症细胞浸润，部分肌纤维变形，间质水肿，心肌组织排列紊乱，心肌纤维广泛变性、断裂，HMGB1抑制组大鼠心肌排列稍有紊乱，炎症细胞浸润及间质水肿减轻（图2）。

图2 HE染色观察大鼠心肌组织病理变化（×20）Fig.2 Pathological change of myocardial tissue in rats by HE staining（×20）

图3 Masson染色观察大鼠心肌组织纤维化程度（×20）Fig.3 Degree of myocardial tissue fibrosis in rats by Mas-son staining（×20）

2.3 HMGB1抑制对MI大鼠心肌纤维化的影响各组大鼠心肌组织Masson染色结果显示，细胞核被染成蓝色，胞浆、肌肉及红细胞被染成红色，间质胶原纤维被染成蓝色。与正常组相比，模型组和HMGB1抑制组大鼠心肌胶原含量明显增加（P＜0.05），与模型组相比，HMGB1抑制组大鼠心肌胶原含量减少，纤维化程度明显减轻（P＜0.05，图3）。

2.4 各组大鼠心肌组织COL-Ⅰ、MMP-2和TGF-β1蛋白表达 模型组大鼠心肌组织COL-Ⅰ、MMP-2和TGF-β1蛋白表达较正常组显著提高（P＜0.05），而HMGB1抑制组大鼠心肌组织COL-Ⅰ、MMP-2和TGF-β1蛋白表达较模型组显著降低（P＜0.05，图4）。

图4 Western blot观察大鼠心肌组织中COL-Ⅰ、MMP-2、TGF-β1表达Fig.4 Western blot to observe expressions of COL-Ⅰ，MMP-2 and TGF-β1 in rat myocardium

2.5 HMGB1抑制对TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响 与对照组相比，模型组和HMGB1抑制组大鼠HMGB1、TLR4和p-NF-κB蛋白表达明显升高（P＜0.05），与模型组相比，HMGB1抑制组HMGB1、TLR4和p-NF-κB蛋白明显降低（P＜0.05，图5）。

图5 Western blot检测大鼠心肌组织HMGB1、TLR4和p-NF-κB蛋白表达Fig.5 Protein expressions of HMGB1，TLR4 and p-NFκB in rat myocardium detected by Western blot

3 讨论

MI后心肌细胞由于缺氧导致损伤甚至凋亡，心肌重塑导致心衰，影响心脏功能，导致机体生命活动受限甚至死亡。心肌纤维化是多数心血管疾病进展的主要原因，通常引起心肌和血管壁结构变化［7］。心肌纤维化过程中，COL-Ⅰ合成增加，心脏僵硬度提高，导致顺应性降低和舒张充盈下降［8］。研究表明，MMP-2参与心肌组织纤维化过程，TGF-β及其信号转导途径积极参与心肌细胞凋亡及心肌肥大，是导致心肌纤维化的关键因素，三者均参与心肌组织纤维化过程［9-10］。本研究发现，阻断后HMGB1，大鼠心肌组织COL-Ⅰ、MMP-2和TGF-β1表达较模型组明显下降，表明抑制HMGB1可对心肌组织纤维化具有一定保护作用。

I/R过程中释放大量免疫原性代谢产物，激活先天免疫系统细胞，上调浸润性炎症反应［11］。炎症反应在心肌组织纤维化过程中发挥促进作用，可刺激心肌胶原纤维异常增多，导致心肌重塑［5］。本研究通过抑制HMGB1发现，大鼠心肌组织炎症浸润及心肌细胞水肿明显减轻，心肌胶原纤维含量明显减少。HMGB1诱导细胞因子释放和促炎过程中的主要受体是TLR4，两者结合激活核转录因子NF-κB信号通路，促进炎症因子表达，I/R炎症反应主要由HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路引起［12-13］。本研究证实，MI后HMGB1蛋白在心肌组织中表达明显增高，TLR4和p-NF-κB蛋白表达变化与HMGB1蛋白表达一致，而阻断HMGB1后3个蛋白表达较模型组下降。研究表明，血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）可诱导分泌COL-Ⅰ［14］。而TLR4/NF-κB信号通路活化可降低AngⅡ水平，进而降低COL-Ⅰ表达［15］。下调TLR4/NF-κB/TGF-β1通路可减轻阿霉素大鼠肾纤维化［16］，证明TGF-β1这一多功能细胞因子与TLR4/NF-κB信号通路共同调节纤维化过程。因此，推测阻断HMGB1通过影响TLR4/NF-κB信号通路减轻心肌炎症反应进而抑制心肌纤维化，保护心肌。

综上所述，HMGB1阻断可减轻MI导致的纤维化，可能通过影响TLR4/NF-κB信号通路进而减轻炎症反应实现。