二氟甲基鸟氨酸对糖尿病合并抑郁症大鼠的认知功能障碍及血清代谢组学的调节作用①

李文慧 张 杰 刘旭恩（新乡医学院第二附属医院（河南省精神病医院）精神五科，新乡 453003）

近年，糖尿病和抑郁症极大加剧了全球疾病负担，二者之间的关系也逐渐引起医疗人员的兴趣［1］。糖尿病患者经常会出现心理健康问题，抑郁症在糖尿病患者中的发病率是普通人群的两倍，且与预后不良相关［2］。有抑郁症状的人发生糖尿病的风险比无抑郁症状的人高37%～60%［3］。糖尿病与抑郁症的合并症是一项主要的临床挑战，因为每种疾病都会因另一种疾病的存在而恶化［4］。糖尿病与抑郁症共病患者的治疗包括常规药物治疗、心理治疗及联合治疗。目前应用的药物往往仅单独针对抑郁症或糖尿病。二氟甲基鸟氨酸是公认的最有效的鸟氨酸脱羧酶特异性抑制剂，可作为鸟氨酸脱羧酶的底物，导致鸟氨酸脱羧酶发生不可逆的结构改变，减少细胞内多胺含量［5］。已有研究表明，二氟甲基鸟氨酸抑制2型糖尿病大鼠的心肌细胞凋亡、心肌肥厚及内质网应激［6-7］。目前尚无关于二氟甲基鸟氨酸对糖尿病合并抑郁症的研究。本文旨在研究二氟甲基鸟氨酸对糖尿病合并抑郁症大鼠的认知功能障碍及血清代谢组学的调节作用的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物60只SD大鼠购自成都达硕实验动物有限公司，雄性，7周龄，体重（210±15）g，许可证号：SYXK（川）2014-189，置于温控（22±1）℃和光控（200 lux，12 h光暗循环）动物设施中常规饲养7 d。

1.1.2 药物与主要试剂 二氟甲基鸟氨酸（D193）购自美国Sigma-Aldrich，化学式：C6H12F2N2O2·xHCl·yH2O，分子量：182.17，纯度≥98%；苏木素-伊红染液（D006-1-1）、5-羟色胺试剂盒（H104）购自南京建成生物工程研究所；5-羟吲哚乙酸试剂盒（HJIR-12628）购自厦门慧嘉生物科技有限公司；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（C1091）购自上海碧云天生物技术研究所；兔抗单克隆抗体Survivin（ab469）、Ki67（ab15580）、Bax（ab53154）、Bcl-2（ab196495）、GLT-1（ab231014）、BDNF（ab226843）、AMPKα1（ab3759）、PGC-1α（ab54481）、GLUT4（ab454）购自美国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 模型建立与分组 参考王宇红等［8］方法建立糖尿病并发抑郁症动物模型，并随机分为5组：对照组（Control）、模型组（Model）、二氟甲基鸟氨酸低剂量组（DFMO 0.1）、二氟甲基鸟氨酸中剂量组（DFMO 0.25）、二氟甲基鸟氨酸高剂量组（DFMO 0.5）。二氟甲基鸟氨酸低、中、高剂量组分别用0.1、0.25、0.5 mmol/L二氟甲基鸟氨酸灌胃给药，对照组及模型组灌胃同等体积生理盐水，灌胃持续28 d。

1.2.2 HE染色 将脑组织以10%福尔马林固定并进行石蜡包埋切片厚度为4µm。用二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，苏木素染色，水洗，盐酸乙醇分化，水洗蓝化，伊红染色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察组织并拍照。

1.2.3 TUNEL染色 将脑组织石蜡切片脱蜡处理，滴加20µg/ml不含DNase的蛋白酶K，20℃～37℃作用20 min，PBS洗涤3次，加入50µl TUNEL检测液，37℃避光孵育1 h，PBS洗涤1次，滴加0.2 ml标记反应终止液，室温孵育10 min后，PBS洗涤3次，继续在样品上加50µl Streptavidin-HRP工作液，室温孵育30 min后PBS洗涤3次，最后滴加0.3 ml DAB显色液后于荧光显微镜下观测。

1.2.4 RT-PCR TRIzol法提取各组大鼠脑组织中总RNA，Nanodrop分光光度计测定吸光度值（A260/A280），按照试剂盒说明书进行cDNA合成和PCR扩增，反应条件为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，扩增35个循环，72℃延长10 min；存储于4°C条件下。反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离。

1.2.5 血清素和5-羟吲哚乙酸含量检测 试剂盒检测serotonin（5-HT）和metabolite 5-hydroxyindole‑acetic（5-HIAA）含量。采用高效液相色谱-电化学检测仪系统检测，每次进样20µl，流动相流经色谱柱的速度为0.5 ml/min。

1.2.6 血脂指标 采用全自动生化分析仪测定大鼠血脂指标总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平。

1.2.7 Western blot将各组大鼠脑组织冰上溶解25 min，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液进行总蛋白提取，BCA试剂盒测定蛋白质含量；提取等量的蛋白质样品（20 mg），100℃变性5 min后，SDSPAGE凝胶电泳分离并转移至PVDF膜，5%BSA室温封闭1～2 h后加入相应一抗，4℃过夜孵育，次日，清洗后再加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h，清洗。加入发光液后，于凝胶成像仪进行曝光拍照，Image J软件统计灰度值计算相对表达量。GAPDH作为上样量参照，至少重复3个独立实验。

1.3 统计学分析 所有实验数据均用SPSS19.0统计软件进行统计分析，实验结果以±s表示，两两比较用独立t检验，组间差异采用单因素方差分析检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 二氟甲基鸟氨酸改善糖尿病合并抑郁症大鼠模型海马神经元病理损伤程度 如图1所示，Con‑trol组海马神经元形态规则，排列整齐，染色均匀，间隙正常。Model组海马神经元胞体肿胀，核固缩，呈空泡状，排列紊乱。DFMO 0.1、0.25、0.5组海马空泡数明显减少，病理损伤程度明显减轻。

图1 二氟甲基鸟氨酸对糖尿病合并抑郁症大鼠模型海马神经元的影响Fig.1 Effects of difluoromethylornithine on hippocampal neurons in diabetic rats with depression

2.2 二氟甲基鸟氨酸促进糖尿病合并抑郁症大鼠模型细胞凋亡 如图2所示，细胞核呈现黄褐色为阳性细胞，即凋亡细胞。Model组阳性细胞明显多于Control组，DFMO剂量组凋亡阳性细胞数明显减少，表明DFMO抑制细胞凋亡。

图2 二氟甲基鸟氨酸对糖尿病合并抑郁症大鼠模型海马神经元细胞凋亡的影响Fig.2 Effect of difluoromethornithine on apoptosis of hip-pocampal neurons in diabetic rats with depression

2.3 二氟甲基鸟氨酸升高糖尿病合并抑郁症大鼠模型Survivin mRNA水平、Bcl-2/Bax，降低Caspase-3 mRNA水平 如表1所示，与Control组相比，Model组和DFMO 0.1、0.25组Survivin mRNA水平、Bcl-2/Bax显著降低（P＜0.05），Caspase-3 mRNA水平显著升高（P＜0.05）。与Model组相比，DFMO 0.25、0.5组Survivin mRNA水平、Bcl-2/Bax显著升高（P＜0.05），Caspase-3 mRNA水平显著降低（P＜0.05）。

表1 二氟甲基鸟氨酸对糖尿病合并抑郁症大鼠模型Sur-vivin、Caspase-3 mRNA水平，Bcl-2/Bax的影响（±s）Tab.1 Effects of difluoromethylornithine on Survivin and Caspase-3 mRNA levels and Bcl-2/Bax in dia-betic and depressed rats（±s）

表1 二氟甲基鸟氨酸对糖尿病合并抑郁症大鼠模型Sur-vivin、Caspase-3 mRNA水平，Bcl-2/Bax的影响（±s）Tab.1 Effects of difluoromethylornithine on Survivin and Caspase-3 mRNA levels and Bcl-2/Bax in dia-betic and depressed rats（±s）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with Model，2）P＜0.05.

Groups Dose（mmol/L）Bcl-2/Bax Survivin mRNA（2-ΔΔCt）1.00 0.13±0.031）0.14±0.061）0.65±0.041）2）0.88±0.082）Caspase-3 mRNA（2-ΔΔCt）1.00 3.02±0.381）2.93±0.421）1.79±0.361）2）1.18±0.292）1.23±0.17 0.15±0.041）0.17±0.061）0.63±0.051）2）0.98±0.072）Control Model DFMO DFMO DFMO--0.10 0.25 0.50

2.4 二氟甲基鸟氨酸升高糖尿病合并抑郁症大鼠模型GLT-1、BDNF蛋白水平 如图3所示，与Con‑trol组相比，Model组和DFMO 0.1、0.25组GLT-1、BDNF蛋白水平显著降低（P＜0.05）。与Model组相比，DFMO 0.25、0.5组GLT-1、BDNF蛋白水平显著升高（P＜0.05）。

图3 二氟甲基鸟氨酸对糖尿病合并抑郁症大鼠模型GLT-1、BDNF蛋白表达水平的影响Fig.3 Effect of difluoromethornithine on GLT-1 and BDNF protein expression levels in diabetic rats with depression

2.5 二氟甲基鸟氨酸升高糖尿病合并抑郁症大鼠模型5-HT、5-HIAA含量 如图4所示，与Control组相比，Model组和DFMO 0.1、0.25组5-HT、5-HIAA含量显著降低（P＜0.05）。与Model组相比，DFMO 0.25、0.5组5-HT、5-HIAA含量显著升高（P＜0.05）。

图4 二氟甲基鸟氨酸对糖尿病合并抑郁症大鼠模型5-HT、5-HIAA含量的影响Fig.4 Effects of difluoromethornithine on 5-HT and 5-HI-AA contents in rats with diabetes mellitus compli-cated with depression

2.6 二氟甲基鸟氨酸降低糖尿病合并抑郁症大鼠模型TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平 如表2所示，与Control组相比，Model组和DFMO 0.1、0.25组TC、TG、LDL-C水平显著升高，HDL-C水平显著降低（P＜0.05）。与Model组相比，DFMO 0.25、0.5组TC、TG、LDL-C水平显著降低（P＜0.05），HDL-C水平显著升高（P＜0.05）。

表2 TC、TG、LDL-C、HDL-C水平（±s，mmol/L）Tab.2 Levels of TC，TG，LDL-C，HDL-C（±s，mmol/L）

表2 TC、TG、LDL-C、HDL-C水平（±s，mmol/L）Tab.2 Levels of TC，TG，LDL-C，HDL-C（±s，mmol/L）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with Model，2）P＜0.05.

HDL-C 1.57±0.11 0.51±0.071）0.56±0.061）1.18±0.321）2）1.66±0.292）Groups Control Model DFMO DFMO DFMO Dose--0.10 0.25 0.50 TC 1.33±0.26 4.84±0.521）4.77±0.631）2.91±0.481）2）1.63±0.322）TG 0.32±0.06 1.61±0.381）1.56±0.241）1.14±0.131）2）0.69±0.092）LDL-C 0.14±0.05 0.82±0.071）0.79±0.061）0.41±0.041）2）0.12±0.052）

2.7 二氟甲基鸟氨酸升高糖尿病合并抑郁症大鼠模型AMPKα1、PGC-1α、GLUT4蛋白水平 如图5所示，与Control组相比，Model组和DFMO 0.1、0.25组AMPKα1、PGC-1α、GLUT4蛋白水平显著降低（P＜0.05）。与Model组 相 比，DFMO 0.25、0.5组AMPKα1、PGC-1α、GLUT4蛋白水平显著升高（P＜0.05）。

图5 二氟甲基鸟氨酸对糖尿病合并抑郁症大鼠模型MPKα1、PGC-1α、GLUT4蛋白表达水平的影响Fig.5 Effects of difluoromethornithine on protein expres-sion levels of MPKα1，PGC-1αand GLUT4 in dia-betic rats with depression

3 讨论

糖尿病是临床常见的代谢性疾病，其中2型糖尿病占比约90%［9］。由于糖尿病目前无法根治，患者需要长期服药，给家庭及患者带来严重的经济和心理负担，容易使患者产生焦虑抑郁，而抑郁又影响睡眠、情绪及饮食等，导致患者的胰岛素抵抗加重，β细胞分泌功能减弱，从而导致血糖升高，使糖尿病恶化［10］。糖尿病合并抑郁症的常规治疗效果并不理想，且目前尚无专用药物。CUMS程序是模拟动物抑郁症的经典方法，因为该程序模仿了人类社会常见的压力事件，其有效性也得到了充分证实［11］。本文采用高脂饲料喂养加腹腔注射链脲佐菌素进行糖尿病模型的复制，再进行CUMS模型的复制，观测二氟甲基鸟氨酸对糖尿病合并抑郁症大鼠的影响。本研究发现，二氟甲基鸟氨酸可改善糖尿病合并抑郁症大鼠海马神经元病理损伤程度，通过降低TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平改善血脂水平，通过升高Survivin mRNA水平、Bcl-2/Bax比值，降低Caspase-3 mRNA水平抑制海马神经元细胞凋亡。

糖尿病是认知功能发生障碍的危险因素［12］。海马神经营养缺失会导致谷氨酸浓度上升，影响认知功能，而谷氨酸转运体1（GLT-1）可调控谷氨酸水平，当脑内谷氨酸含量异常升高时，GLT-1通过主动转运将细胞间隙中过量的谷氨酸转运至胶质细胞内代谢消除［13］。脑源性神经营养因子（brain-de‑rived neurotrophic factor，BDNF）是神经营养因子家族的重要成员，通过与相应受体络氨酸激酶B结合对胚胎神经元的生长、发育、诱导分化及突触连接具有调节功能［14］。BDNF表达的降低与海马等认知功能相关脑区的结构紊乱及功能连接异常存在一定关联，参与抑郁症的发生和发展［15］。本研究发现，模型组中GLT-1、BDNF蛋白水平明显降低，在给予二氟甲基鸟氨酸干预后，海马中GLT-1、BDNF明显升高。说明二氟甲基鸟氨酸具有改善糖尿病合并抑郁症大鼠认知障碍的作用。

5-HT能系统是早发性抑郁发病机制中最重要的神经递质系统，“单胺递质假说”认为抑郁的发生与单胺类神经递质5-HT水平低下有关［16］。5-HIAA是5-HT经A型单胺氧化酶作用生成5-羟吲哚乙醛，在醛脱氢酶的催化下生成的无活性酸性代谢终产物，其含量高低也能间接反映5-HT的水平变化。已有研究表明，5-HT能神经递质的减退不仅导致情绪障碍的形成，还可影响其他递质的活动诱发抑郁症［17］。因此，选择5-HT作为抗抑郁药物的治疗靶点，通过直接或间接增加突触中5-HT含量治疗抑郁症［18］。于泽胜等［19］研究发现柴胡白芍药对通过逆转CUMS模型大鼠5-HT、5-HIAA水平的降低起抗抑郁作用。Ziziphi spinosae百合粉悬浮液对通过升高5-HT、5-HIAA含量减轻CUMS模型大鼠的抑郁症状。本文研究发现，二氟甲基鸟氨酸具有升高5-HT、5-HIAA含量的作用。提示二氟甲基鸟氨酸可改善糖尿病合并抑郁症大鼠抑郁症状。

AMPK被称为“细胞能量检测器”，在脂肪组织中，可抑制脂肪分解，降低2型糖尿病患者身体中的高游离脂肪酸循环，改善糖尿病病情［20］。GLUT4是目前最有潜力的抗糖尿病药物的作用靶点之一。研究表明，上调葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）的表达有助于缓解2型糖尿病胰岛素抵抗，从而治疗和预防2型糖尿病［21］。过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子-1α（peroxisome proliferator-activated re‑ceptor-γcoactivator-1α，PGC-1α）是介导多种细胞能量代谢和核受体的重要因子，通过激活脂肪酸氧化、糖异生、线粒体呼吸的关键酶参与了脂代谢紊乱、胰岛素抵抗、线粒体损伤的形成，PGC-1α可通过特定途径增加海马组织中BDNF的表达［22-23］。本文研究发现，二氟甲基鸟氨酸具有升高AMPKα1、PGC-1α、GLUT4蛋白水平的作用，说明二氟甲基鸟氨酸通过激活AMPKα1/PGC-1α/GLUT4通路对大鼠糖尿病合并抑郁症具有改善作用。

本文研究结果表明，糖尿病合并抑郁症大鼠模型中，二氟甲基鸟氨酸可改善大鼠海马神经元损伤及血脂水平，上调GLT-1、BDNF蛋白水平及5-HT、5-HIAA含量。可能是通过激活AMPKα1/PGC-1α/GLUT4实现的。本研究阐明了二氟甲基鸟氨酸治疗糖尿病和抑郁症合并症的潜力。