低温冷冻-超微粉碎洋蓟膳食纤维对肥胖小鼠减肥作用的研究

徐田辉 朱仁威 黄 亮 付晓康 贺 便

(特医食品加工湖南省重点实验室；中南林业科技大学食品科学与工程学院1，长沙 410004)(稻谷及副产品深加工国家工程实验室；中南林业科技大学食品科学与工程学院2，长沙 410004)

洋蓟原产地中海西部和中部地区，在古代已传到地中海东部地区。洋蓟广泛种植于加利福尼亚、法国、西班牙、比利时、地中海附近各国及其他土壤肥沃，气候温和潮湿的地区，在我国陕西省、山东省均有分布[1]。洋蓟营养丰富，在每100克可食部位中，含水量80.5%，脂肪0.2%，蛋白质2.8%，糖类9.9%，维生素A为0.160%，维生素C为0.008%，钙0.051%，磷0.069%、铁0.001.5%[2]，还有对人类有益的菜蓟素，天门冬酰胺以及黄酮类化合物等[3]。

膳食纤维是指不被人体消化吸收，也不产生能量的木质素和多糖类碳水化合物的总称[4]。洋蓟中富含膳食纤维[5]，具有促进有益的生理作用，包括促进排便、促进血液中的胆固醇和葡萄糖衰减、帮助降低便秘[6,7]、憩室病和其他消化道功能紊乱疾病的发生率[8,9]。

低温冷冻-超微粉碎是一种创新的对膳食纤维进行复合改性的方法，其具有消耗能量低，对物料的成分破坏少，并且能够最大程度上对物料的理化性质进行改性[10]。经低温冷冻-超微粉碎后洋蓟膳食纤维使其原有的水合性，膨胀力、持水力、持油力、葡萄糖吸附力以及结晶能力显著增强[11]，且经过复合改性后的洋蓟膳食纤维中所含的可溶性膳食纤维组分明显增多，有利于人体肠道有益菌群的生长，给人体带来益处[12]。目前研究的主要是洋蓟的多酚类化合物、黄酮类化合物以及菜蓟素等物质，鲜有关于洋蓟膳食纤维的报道[13]。本研究采用经低温冷冻-超微粉碎复合改性得到的洋蓟膳食纤维饲喂肥胖小鼠，探讨其对肥胖小鼠的体重、血糖血脂值、腹腔脂肪以及肝脏病变的影响，为洋蓟膳食纤维的减肥作用提供参考[14]。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

50只C57BL/6小鼠，无特定病原体(specific pathogen free, SPF级，动物生产许可证号：SCXK(湘) 2016-0002)，动物质量合格证号为：110727191100 3092。

基础饲料：蛋白质 35.6%，脂肪 44.3%，碳水化合物 20.1%；高脂饲料：基础饲料63.6%、胆固醇1.2%、胆酸钠0.2%、蛋黄粉10%、蔗糖15%、猪油10%。

未经改性洋蓟膳食纤维和低温冷冻-超微粉碎洋复合改性蓟膳食纤维，实验室自制；奥利司他；A111-1-1型总胆固醇试剂盒、A110-1-1型甘油三酯试剂盒；柠檬酸、柠檬酸钠、甲醛等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DNM-9602A酶标仪，甘油三酯值16KR台式高速冷冻离心机，GA-3型血糖仪，GA-3型血糖试纸，Pannoramic MIDI病理切片扫描仪，DW-HL388超低温冰箱，恒温恒湿动物房。

1.3 方法

1.3.1 洋蓟基本成分测定

对未经处理洋蓟膳食纤维、低温冷冻-超微粉碎洋蓟膳食纤维的水分、蛋白含量、粗脂肪、粗灰分、可溶性膳食纤维和不可溶性膳食纤维成分进行测定，分别参考GB 5009.3—2016-kw，GB 5009.5—2016，GB 5009.6—2016，GB 5009.4—2016，GB 5009.88—2014-kw)进行测定。

1.3.2 洋蓟膳食纤维的复合改性

将洋蓟花苞在70 ℃下干燥，通过普通粉碎后过300目筛，将制得的洋蓟花苞粉通过-80 ℃超低温冷冻8 h后，再采用纳米球磨仪对低温冷冻后的花苞粉进行超微粉碎，得到复合改性洋蓟花苞粉(粉碎时间为8 h，洋蓟花苞粉与锆球质量比为1∶5)。将复合改性后的洋蓟花苞粉溶于纯水中，调节溶液至pH4.5，并在60 ℃的水浴中搅拌2 h与蒸馏水以1∶12(m∶V)的比例混合煮沸30 min，将溶液的pH调节至6.5，然后加入0.3%的热稳定α-淀粉酶(耐高温)，并在95 ℃下酶水解持续30 min。将溶液调至pH7.5，然后加入0.6%碱性蛋白酶，在60 ℃温度下酶水解2 h，酶在水浴中冷却至室温，最后将滤液干燥，得到复合改性洋蓟总膳食纤维。对改性后洋蓟膳食纤维组分的粒径、及红外光谱图进行分析。

1.3.3 小鼠肥胖模型的建立

选取50只BALB/c小鼠雌雄各半，先用基础饲料适应性喂养1周，期间室温控制在22～24 ℃，自由进食、饮水，12 h光照周期。1周后随机分成5组，每组10只。取4组小鼠喂养高脂饲料进行肥胖模型的建立。剩余组作为空白对照组(CG)，饲养基础饲料。高脂饲料喂养6周左右，直到模型组体重超过对照组体重的15%即为造模成功[15]。

1.3.4 小鼠的分组给药及解剖

造模成功的小鼠进行编号分组，即高脂模型组(HF)、药物阳性对照组(MC)、未改性洋蓟膳食纤维饲喂组(ADF)以及低温冷冻-超微粉碎洋蓟膳食纤维饲喂组(LU-ADF)。其中HF组继续饲喂高脂饲料，自由饮水，每天灌胃1次20mL/kg生理盐水；MC组继续饲喂高脂饲料，自由饮水，每天灌胃1次60 mg/kg奥利司他溶液；ADF组继续饲喂高脂饲料，自由饮水，每天灌胃1次120 mg/kg未改性洋蓟膳食纤维粉；LU-ADF组继续饲喂高脂饲料，自由饮水，每天灌胃1次120 mg/kg低温冷冻-超微粉碎洋蓟膳食纤维粉[16]。连续灌胃4周后禁食不禁水12 h，称体重和测血糖后取小鼠眼球血，分离血清测定血脂水平。全部小鼠脱臼处死迅速解剖，取肝脏，腹腔脂肪用冷生理盐水漂洗，除去血水，称重后用福尔马林固定以待后期实验数据的测定[17]。

1.3.5 小鼠血清中总胆固醇值、甘油三酯值的测定

将采集到的小鼠眼球血放入采血管内后静置，等血清自然析出后，1 500 r/min，离心8 min，取上清液于EP管中待测，采用酶标仪比色法检测其中总胆固醇值、甘油三酯值的含量[18]。

1.3.6 小鼠肝脏及脂肪组织切片染色观察

将小鼠肝脏及脂肪组织用福尔马林固定48 h，流水冲洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，透蜡，包埋，脱蜡切片，苏木精-伊红(HE染色)，扫描仪观察肝脏及脂肪组织结构[19]。

1.3.7 数据处理与统计分析

所有实验平行3次，数据采用Microsoft Excel 2016进行处理，Origin2017作图，结果均采用平均值±标准差的形式表示，通过SPSS 22.0进行分析数据，采用方差分析和t检验，P<0.05有显著差异，P<0.01有极显著差异。

2 结果与讨论

2.1 各组洋蓟膳食纤维基本成分分析

由表1可得出，经过低温冷冻-超微粉碎处理的洋蓟膳食纤维中可溶性膳食纤维组分明显增多，不可溶性膳食纤维组分明显降低，这可能是因为在改性过程中，不可溶性组分在冷冻和粉碎的过程中，更多的亲水性基团暴露，导致可溶性组分增加。除了膳食纤维组分外，水分、蛋白、粗脂肪以及粗灰分的含量也发生了变化，推测可能是在检测过程中存在误差导致的，可忽略不计。

表1 洋蓟膳食纤维成分表/g/100 g

2.2 洋蓟膳食纤维粒径、葡萄糖吸收能力以及红外光谱分析

由图1a分析可得随着低温冷冻时间的延长，低温冷冻-超微粉碎复合改性的方法可使洋蓟膳食纤维的粒径分布更加均匀和集中；未进行低温冷冻处理的洋蓟膳食纤维，其粒径分布较不均匀，虽然有部分粒径较低，但总体分布上仍然存在较多粒径过大的颗粒。这是由于洋蓟膳食纤维进行低温冷冻处理后，其本身的脆性增加，韧性降低，在超微粉碎时更容易被粉碎。

图1 复合改性前后洋蓟膳食纤维粒径及红外光谱分析图

2.3 洋蓟膳食纤维对小鼠体重的影响

注：CG：空白对照组、HF:高脂模型组、MC：药物阳性对照组、ADF：未改性洋蓟膳食纤维饲喂组、LU-ADF：低温冷冻-超微粉碎洋蓟膳食纤维饲喂组。图2 洋蓟膳食纤维对小鼠体重的影响

由图2可以看出造模期间，CG组体重增长明显低于其他实验组，其余几组增长趋势一致。第7周开始进入给药期，CG组和HF组在第1周略有下降后依旧保持上升趋势；灌胃阳性药物和膳食纤维的小鼠体重均开始下降，在第13周药物组体重下降到低于CG组，LU-ADF组也接近CG组的体重，ADF组小鼠体重仍然高于CG组，但相比于HF组也显著降低[21]。王学敏等在燕麦纤维对小鼠的润肠通便功能研究中发现，适当剂量的燕麦纤维干预能够有效的对小鼠的肠道起到润肠通便的作用[22]，实验组中采用燕麦纤维干预的小鼠体重均呈下降趋势，与本研究基本一致。

2.4 洋蓟膳食纤维对小鼠血糖的影响

图3可以看出HF组和MC组血糖显著升高，MC组虽然对体重降低很有帮助但是对血糖的抑制效果不显著。LU-ADF组相对于ADF组其抑制血糖上升的能力较为显著[23]。这是因为在溶液中有较大粘性的SDF能将葡萄糖分子包裹在其中，从而降低人体对葡萄糖的吸收，且复合改性处理后的洋蓟膳食纤维中的SDF含量显著增加，有效提高样品对葡萄糖吸附能力。苏玉[24]在蒸汽爆破-超微粉碎对米糠膳食纤维改性的研究中发现，经过改性后的米糠膳食纤维具有更优秀的吸附小鼠肠道中的血糖，使小鼠达到降低血糖的目的，同时小鼠体重也有明显降低，与本研究基本一致。

注：CG：空白对照组、HF:高脂模型组、MC：药物阳性对照组、ADF：未改性洋蓟膳食纤维饲喂组、LU-ADF：低温冷冻-超微粉碎洋蓟膳食纤维饲喂组；*表示与模型组相比的差异性(P<0.05)；△表示与空白组相比的差异性(P<0.05)。下同。图3 小鼠血糖水平

2.5 洋蓟膳食纤维对小鼠血脂值的影响

由图4可以看出HF组总胆固醇和甘油三酯值最高，MC组测量结果均低于CG组，ADF组和LU-ADF组结果略高于CG组，并且均显著低于HF组，虽然膳食纤维组的血脂水平未能达到CG对照组，但显著降低了小鼠血清中总胆固醇值、甘油三酯值的浓度，说明膳食纤维对小鼠有一定的降血脂作用。卢宏科等[25]发现肝脏中的胆固醇经过代谢后变成胆酸，胆酸到达小肠消化脂肪，随后胆酸被小肠吸收回肝脏转变成胆固醇。这是由于膳食纤维在小肠中能形成胶状物质将胆酸包围，胆酸将不再被小肠壁吸收进入肝脏，而是通过消化道被排出体外。因此，肝脏只能通过吸收血液中的胆固醇来补充消耗的胆酸，从而降低血液中胆固醇的含量，与本研究基本一致。经过低温冷冻-超微粉碎复合改性的膳食纤维暴露出更多的功能基团，使其吸附性能得到显著提升，从而达到更好降低血脂的作用。张薇等[26]在谷物膳食纤维对脂代谢紊乱小鼠肝脏毒性影响的研究中发现，经过谷物膳食纤维干预的实验组小鼠，其肝脏毒性得到明显缓解，小鼠血脂明显低于模型组，与本研究基本一致。

图4 小鼠血脂水平

2.6 洋蓟膳食纤维对小鼠腹腔脂肪的影响

图5为小鼠腹腔脂肪形态学切片，可看出HF组小鼠腹部大网膜脂肪体积明显大于其他组，脂肪细胞膜不完整，炎性细胞增多。CG组小鼠腹腔脂肪大小均匀，排列紧密，脂肪组织的细胞间质很少，可见少量炎性细胞浸润；MC组和LU-ADF组对比HF组均有显著的改善，未见细胞膜破损和大量炎性细胞浸润，表现接近CG组小鼠腹腔脂肪，ADF组细胞大小偏大，但组合相比HF组更有序。申瑞玲等[27]在其研究中指出，在短期内燕麦水不溶性膳食纤维会达到更好的减肥作用，但是长期来看，可溶性膳食纤维能够更好地降低小鼠肝脏指数、总胆固醇值和甘油三酯值水平，促进肝酯酶和脂蛋白酶活性有效调节肝脏代谢紊乱。本研究中，经过低温冷冻-超微粉碎复合改性的洋蓟膳食纤维在LU-ADF组的实验结果中表现优异，由于其含有较多的可溶性洋蓟膳食纤维组分，对于肝脏的保护显著优于未经过复合改性的洋蓟膳食纤维。

注：A为HF：高脂模型组；B为MC：药物阳性对照组；C为CG：空白对照组；D为ADF：未改性洋蓟膳食纤维饲喂组；E为LU-ADF：低温冷冻-超微粉碎洋蓟膳食纤维饲喂组。下同。图5 小鼠腹腔脂肪切片

图6 小鼠肝脏组织切片

2.7 洋蓟膳食纤维对小鼠肝脏的影响

各组小鼠肝脏组织切片如图6所示。HF组小鼠肝脏细胞肿胀，排列杂乱无序，细胞周围弥漫分布的微脂滴，可见肝细胞气球样变(肝细胞受损后水分增多引起胀大、胞浆疏松化，进一步发展肝细胞胀大如球形，胞浆几乎透明、淡染)，与张君等[28]在研究肥胖、2型糖尿病过程中大鼠肝脏形态结构变化中对大鼠肝脏进行切片包埋镜检得到的结果相同。CG组小鼠肝脏结构有序、细胞着色均匀，未见脂肪空泡，说明基础饲料对小鼠的生长无不良影响；与HF组相比LU-ADF组与ADF组小鼠肝脏病变情况均有好转，但LU-ADF组对于预防肝脏病变的效果更佳明显，细胞排列整齐，ADF组仍有有少量白色脂滴；本实验观察到的HF组小鼠肝脏细胞肿大，脂肪滴堆积可能是因为过量摄入高脂饲料超出肝脏可承受的范围，而导致肝脏代谢紊乱，肝内脂肪发生蓄积，引起脂肪肝。洋蓟膳食纤维能缓解肥胖引起的肝损伤，且能减轻肝脏肿大和脂肪肝的原因可能是由于其具有一定的降血脂的作用，从而调节肝脏脂代谢，改善肥胖小鼠脂肪肝的症状。

3 结论

利用低温冷冻-超微粉碎复合改性洋蓟膳食纤维干预肥胖小鼠，通过对小鼠的各项生理指标的测定，研究洋蓟膳食纤维对肥胖小鼠的影响。复合改性洋蓟膳食纤维能显著改善小鼠肥胖的典型特征，小鼠实验证明在复合改性洋蓟膳食纤维的干预下，小鼠的体重、脂肪湿重、血糖、血脂水平显著下降，对小鼠腹腔脂肪进行病理切片观察可以看出复合改性洋蓟膳食纤维对高脂饮食带来的肝脏病变有良好的预防和改善作用。本研究仅在洋蓟膳食纤维的层面上研究其对小鼠减肥的作用机制，今后需要从洋蓟膳食纤维中分离出具体发挥减肥作用的物质，探索膳食纤维发挥减肥的作用机制。