miRNA-27α调控PPARγ/ApoA5通路对大鼠激素性股骨坏死的影响研究

黄涛，崔泳

(新疆医科大学第五附属医院骨科，新疆 乌鲁木齐 830000)

激素性股骨头坏死(steroid induced femoral head necrosis，SFHN)从发生起3年内便可发生股骨头塌陷，最终超过65%的患者不得不接受髋关节置换手术，给患者家庭和社会带来了巨大经济负担[1-2]。然而，SFHN的发病机制方面的研究还有限。研究表明miRNA-27α的许多靶向基因与骨重建和骨骼发育有关[3]。如miRNA-27α通过直接抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor，PPARγ)的表达发挥相应的生物学功能[4-5]。我们的前期研究表明，载脂蛋白A5(apolipoprotein A5，ApoA5)的两个等位基因(rs662799和rs3135506)均与国人股骨头坏死密切相关[6]。

动物模型的建立对于评价药物是否有临床价值具有重要的意义。本研究选择大鼠做动物模型，是因为大鼠有90%基因与人类一致，同时构建成功率高，发生骨坏死的病理特征也与人类一致。同时大鼠与人类的股骨头形状有着较为类似的前倾角和颈干角，力学性能可能更接近人类[3]。本研究拟通过构建激素性股骨头大鼠模型，在模型成立前腹腔注射含高表达和低表达miRNA-27α质粒的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)细胞悬液，进一步观察股骨头坏死进展情况。探讨激素调控鼠股骨头内miRNA-27α的表达机制，进一步分析下游靶基因PPARγ和ApoA5的表达，最终为有效地干预SFHN的进展提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 激素型股骨头坏死大鼠模型构建和分组 30只SPF级SD雌性大鼠(体重200～230 g)购自新疆医科大学动物实验中心(动物合格证号：NO.801205226112)。根据随机数字法分为5组，每组6只，分别为生理盐水肌注组，甲泼尼龙肌注4周组，甲泼尼龙4周+转染含miRNA-27α mimics慢病毒BMSCs细胞悬液组，甲泼尼龙4周+转染含miRNA-27α inhibitor慢病毒BMSCs细胞悬液组，甲泼尼龙4周+转染含空载慢病毒BMSCs细胞悬液组。所有需甲泼尼龙注射组(模型组)给予腹腔注射脂多糖(20 ng/kg，溶于1 mL生理盐水中，Sigma，美国)，24 h后两侧臀肌交替注射甲泼尼龙(40 mg/kg，溶于1 mL生理盐水中，辉瑞，美国)3次，每次间隔24 h。空白对照组腹腔及臀肌注射等量(1 mL)生理盐水。本研究获得新疆医科大学伦理委员会的批准。

1.2 组织病理学检查 将股骨置入中性甲醛溶液固定72 h后，使用30%甲酸脱钙3 d，脱钙完全后梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片厚度4um，常规伊红-苏木精(hematoxylin eosin，HE)染色。骨坏死定义：HE染色观察到空骨陷窝形成、骨髓坏死、骨小梁断裂为骨坏死形成。

1.3 BMSCs的分离与培养 磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)冲洗大鼠股骨骨髓，获得BMSCS，用Percoll溶液重悬(密度1.083)，室温下以2 500 rpm离心20 min，并用PBS洗涤两次。细胞在含有10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)，100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的Dulbecco’s改良Eagle培养基：营养混合物F-12(dulbecco’s modified eagle media：nutrient mixture F-12，DMEM/F12)1︰1完全培养基中培养。待细胞汇合度为90%时，用含有0.02%乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)的胰蛋白酶消化后传代。

1.4 miRNA-27α mimics和inhibitor慢病毒的构建 向培养好的BMSCs中加入含目的序列(miRNAbas查询miRNA-27α的序列GCGGCGGTTCACAGTGG CTAAG)的穿梭质粒和包装质粒(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)混匀。配置转染混合物，逐滴加入15 cm培养皿中后温育。离心后收集病毒用于转染。

1.5 慢病毒转染BMSCs 实验前1天将细胞按照(3～5)×103的浓度接种于96孔板中，每孔加培养基100 μL。确定Polybrene是否可以促进转染及最佳感染复数值(multiply of infection，MOI)，按MOI分别加入不同分组的慢病毒mimics、inhibitor、vector，同时每瓶T75加入5 μg/mL polybrene，共同培养后荧光观察。

1.6 干细胞注射 造模后4周进行干细胞注射。具体步骤如下：准备已经转染慢病毒的干细胞。将大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉后，膝关节正中纵形切口切开膝关节皮肤，以髌韧带为定位。向股骨髓腔注射200 μL，约含106个的BMSCs。饮用水中给予口服阿莫西林抗感染1周。

1.7 骨组织RNA的提取和qPCR 用miRNAeasy试剂盒(Qiagen，USA)分离骨组织总RNA(包括miRNA)。分析提取RNA的浓度和纯度后用两步RT-PCR试剂盒(全式金，北京)合成互补DNA(cDNA)。采用Peimer 5.0设计引物，由上海生工生物技术服务有限公司合成，引物信息见表1。qPCR反应在Roche LightCycler 480 Ⅱ荧光定量PCR仪上进行，每板上设置标准品(所有样品的混合溶液，重复3次)和1个阴性对照(水)。

表1 引物序列及基因长度

1.8 细胞增殖与活力检测 细胞增殖采用CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega，北京)试剂盒测定。

用5 μg/mL荧光素二乙酸酯(fluorescein diacetate，FDA)(Life Technologies，USA)和20 μg/mL碘化丙啶(propidium iodide，PI)(Life Technologies)在PBS中对细胞进行染色。在激光扫描共聚焦显微镜进行观察和拍摄，判断细胞活力。

2 结 果

2.1 动物模型的一般结果 模型构建过程中，模型组和对照组实验动物精神良好，体型健康，无其他疾病发生，体重逐渐增加。对照组体重增加(41.28±3.61)g，模型组体重增加(40.38±4.02)g。对大鼠对照组和模型组股骨头HE染色分析发现，与对照组股骨头内骨小梁的结构完整，无断裂相比，激素诱导大鼠股骨头切片显示骨小梁出现稀疏、断裂、排列紊乱，同时骨小梁的面积显著减少(见图1)。

a 对照组 b 模型组

2.2 激素诱导大鼠股骨头BMSCs分离 新鲜分离和培养的骨髓间充质干细胞贴壁生长，大多数呈多边形形态(图2a)。3周后，骨髓基质细胞形态类似于成纤维细胞，几乎没有污染细胞(图2b)。

a 新鲜培养的骨髓间充质干细胞 b 分化后的骨髓基质细胞形态

2.3 激素诱导大鼠股骨头坏死模型中miRNA-27α的表达 qPCR分析对照组及激素诱导大鼠股骨头坏死模型组中的miRNA-27α的表达水平(见图3)。与对照组相比，模型组中miRNA-27α的含量显著降低(P<0.05)。

图3 miRNA-27α在对照组和SFHN模型中的表达

2.4 激素诱导大鼠股骨头坏死模型中PPARγ、ApoA5的mRNA表达 应用qPCR检测对照组及激素诱导大鼠股骨头坏死模型组中PPARγ和ApoA5 mRNA表达(见图4)。与对照组相比，PPARγ和ApoA5 mRNA表达水平在激素诱导大鼠股骨头坏死模型组中均显著升高(P<0.05)。

图4 PPARγ和ApoA5在对照组和SFHN模型中的表达

2.5 激素诱导大鼠股骨头坏死模型中mi RNA-27α与PPARγ和ApoA5的相关性分析 PPARγ与miRNA-27α呈现负相关，其中相关系数R2=0.725；ApoA5与miRNA-27α也呈现负相关，相关系数R2=0.683(见图5)。

2.6 注射miRNA-27α mimics/inhibitor BMSCs细胞后大鼠PPARγ和ApoA5表达变化 注射miRNA-27αmimics/inhibitor BMSCs细胞后PPARγ和ApoA5表达变化见图6。结果表明，相对于肌注甲泼尼龙组，同时注射甲泼尼龙和miRNA-27α mimics组，PPARγ和ApoA5 mRNA表达水平均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；而同时注射甲泼尼龙和miRNA-27α inhibitor组PPARγ和ApoA5 mRNA表达水平均显著升高(P<0.05)。

2.7 注射miRNA-27α mimics/inhibitor BMSC细胞对股骨头BMSCs增殖和活力的影响 从第2天到第8天，对照组的细胞增殖水平明显高于甲泼尼龙诱导的股骨头坏死组，添加miRNA-27α mimics组细胞增殖水平显著高于miRNA-27α inhibitor组(见图7)。细胞活力结果如图7所示，添加甲泼尼龙组软骨细胞的存活率都显著降低，但同时添加甲泼尼龙和miRNA-27α inhibitor组产生了更大的抑制作用。说明miRNA-27α能延缓甲泼尼龙产生对BMSCs产生的抑制作用。这些结果与细胞增殖实验结果一致。

图5 SFHN模型中miRNA-27α与PPARγ和ApoA5的相关性分析 图6 注射miRNA-27α mimics/inhibitor BMSC细胞后大鼠股骨头PPARγ和ApoA5表达变化

注：miRNA-27α inhibitor/mimics处理后对BMSCs活性和凋亡影响

3 讨 论

酗酒和长期使用激素药物是导致FHN的主要因素[7-9]。激素可引起高脂血症，进而影响股骨头微循环从而在多方面导致股骨坏死，如微血管内脂肪栓子形成等[10-12]。甲泼尼龙是临床上常用的糖皮质激素类药物。本研究目的之一是通过甲泼尼龙诱导建立大鼠股骨头坏死的体外模型。结果表明，与正常小鼠相比，激素诱导大鼠股骨头切片显示骨小梁出现稀疏、断裂、排列紊乱，同时骨小梁的面积显著减少。该结果得到了先前发表的研究的支持[13-14]。

miRNAs是多种生理过程的有效调节因子，包括细胞增殖、分化和凋亡[15]。最近有报道称miRNAs对成骨细胞分化的调控至关重要[16-17]。Schoolmeesters等[10]在研究人间充质干细胞向成骨细胞分化时发现，miR-148b、miRNA-27α、miR-489参与调节间充质干细胞的成骨分化。其中，miRNA-27α的许多靶向基因与骨重建和骨骼发育有关。已有研究证明，PPARγ的3′-UTR区域包含miRNA-27α结合位点，miRNA-27α通过直接抑制PPARγ的表达发挥相应的生物学功能[9-10]。同时，Vu-dacN等[11]发现ApoA5启动子上包含过氧化物酶体增殖物反应元件(peroxisome proliferators responsive element，PPRE)是PPARγ的靶基因。我们的前期研究中也显示，ApoA5的两个等位基因(rs662799和rs3135506)均与国人股骨头坏死密切相关[12]。本研究结果表明，与对照组相比，激素诱导大鼠股骨头坏死模型组中miRNA-27α的含量显著降低，而PPARγ和ApoA5 mRNA表达水平在激素诱导大鼠股骨头坏死模型组中均显著升高，PPARγ和ApoA5与miRNA-27α表达呈负相关。

骨髓基质细胞向脂肪细胞分化的过程中多种因子调控转录因子PPARγ的表达，引起骨髓基质细胞向成骨细胞分化减少，最终导致股骨头发生坏死[18]。PPARγ基因突变的小鼠脂肪细胞分化受抑制的同时，成骨细胞分化的相关基因高表达，成骨细胞大量分化[19]。ApoA5启动子上包含PPRE反应元件，是PPARγ的靶基因，并且干预骨髓干细胞的成脂成骨分化，而miRNA-27α的许多靶向基因与骨重建和骨骼发育有关。本研究中，相对于肌注甲泼尼龙组，同时注射甲泼尼龙和miRNA-27α mimics组，PPARγ和ApoA5 mRNA表达水平均显著降低，而注射甲泼尼龙和miRNA-27α inhibitor则结果相反，同时在大鼠激素股骨头坏死模型中还观察到添加miRNA-27α mimics组细胞增殖水平显著高于miRNA-27α inhibitor组。表明miRNA-27α可通过PPARγ/ApoA5通路调控骨髓干细胞的成脂成骨分化并在激素性股骨头坏死发生过程中起到延缓作用。