利用带血管骨膜重建腱-骨、腱-假体止点的实验研究

茹能，梁杰

(三峡大学人民医院骨科，湖北 宜昌 443000)

临床上常可见到各种原因引起的关节及关节周围骨组织破坏，关节周围的腱性组织丧失了正常的腱-骨附着点，导致关节活动障碍的病例，寻找一种简单有效的修复方式成为骨科修复领域的难题。目前在治疗骨缺损、修补腱-骨止点的手术方法中，骨膜移植已成为临床最佳选择方法[1]。其优点为骨膜质地软易于成形，便于原位切取、不需要增加额外损伤，对供区伤害小等。因此，本实验探讨能否利用游离骨膜在修复骨缺损的同时重建腱-骨止点，能否利用游离骨膜在内植物假体表面原位建立腱-骨-假体连接的可能性。

1 资料与方法

1.1 实验对象 本研究实验对象为30只兔龄在18周龄新西兰大白兔，雌雄不限，体重2.5～3.5 kg。

1.2 动物模型及手术方法 随机挑选实验兔2只，取双侧上肢做为正常空白对照组。余下28只随机分为A、A1、B、B1组，分别选取左、右上肢显露肱二头肌肌腱在桡骨上端止点切断，游离尺动脉，尺动脉较为恒定的在鹰嘴下1.2～1.5 cm处发出一支粗大的骨膜支长入骨膜，以穿入点为中心切取骨膜面积为1.0 cm×0.8 cm。咬除桡骨骨组织，制造不低于0.5 cm的骨性缺损。骨断端以人指骨内固定钛板固定，采用4种不同方法修复。A组：将肌腱断端置于缺损处中央，取带尺动脉的尺骨后外侧骨膜瓣，包裹缺损部及肌腱断端并缝合固定。A1组：将肌腱止点断端缝合于骨缺损处骨组织断端，不以游离骨膜覆盖。B组：将肌腱止点缝合于钛板上，骨膜瓣包裹骨缺损及钛板-肌腱止点缝合处。B1组：将肌腱止点断端缝合于内固定钛板上，不以游离骨膜覆盖。

1.3 检测指标

1.3.1 透视观察 术后6周、12周进行X线透视观察，按Lane-Sandhu X射线评分标准从成骨程度、连接程度、骨髓腔改建程度3方面进行评分(见表1)。

1.3.2 镜下观察 术后6周和12周样本切片后行苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)镜下观察，检测指标为：(1)HE染色细胞密度的计数；(2)腱长入厚度；(3)腱-骨止点周围毛细血管计数。

1.3.3 细胞因子测定 以腱-骨结合部免疫组化染色积分光密度(integral optical density，IOD)检测骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)表达量。

1.3.4 生物力学测试 样本固定于生物力学试验机，肱二头肌肌腱与桡骨骨干呈20°进行拉力测试，先行上下循环负荷加载，加载区间为10～80 N，拉力达到2.0 N时用电子游标卡尺测量腱-骨止点横截面积，然后按0.5 mm/s拉伸速度行拉断实验，比较各组腱-骨界面的抗拉强度。

2 结 果

2.1 透视观察 A、B两组6周后有明显骨痂生成，12周后骨缺损处已恢复骨连续性，A1、B1组透视12周后仅1份标本可见骨痂连续，其余均为骨不连。按Lane-SandhuX射线评分标准进行评价，见表2。

2.2 HE染色镜下观察 A组6周后见腱-膜组织交界处不规则钙化斑，骨母细胞较多，12周后未见“潮线”样结构，成熟骨细胞数量多于骨母细胞，未见直接愈合的典型4级结构形成。A1组6周后镜下骨母细胞数量少于A组，钙化斑密度低于A组，12周成熟骨细胞数量和骨母细胞较6周时增多，但少于同期A组(见图1～2)。B组6周镜下见腱-假体-骨膜界面结合部瘢痕组织和增生的肌组织增生，骨膜内置物侧未见钙化影，12周镜下见内植物-骨膜界面骨膜下骨母细胞数量增多，部分纤维组织与腱组织相互长入，无sharpey样纤维结构形成。内植物侧骨膜下极少钙化骨组织(见图3)。B1组肌腱止点均断裂，在本实验中无观测意义，予以剔除。镜下统计A组、A1组、B组成熟骨细胞和骨母细胞数量、毛细血管数量及腱-骨长入厚度作对比(见表3)。

表1 Lane-Sandhu X射线评分标准

表2 Lane-Sandhu X射线评分分)

成熟骨细胞计数：6周后A、A1组比较t=14.74，P<0.01；B、A1组比较t=21.83，P<0.01；A、B组比较，t=30.31，P<0.01。12周后A、A1组比较t=16.73，P<0.01；B、A1组比较t=31.34，P<0.01；A、B组比较，t=38.72，P<0.01。骨母细胞计数：6周后A、A1组比较t=7.25，P<0.01；B、A1组比较t=7.86，P=0.01；A、B组比较t=2.26，P>0.05。12周后B、A1组比较t=10.23，P<0.01；A、B组比较t=11.82，P<0.01；A、A1组比较t=1.52，P=0.11。毛细血管数量：6周后A、A1组比较t=4.25，P=0.01；B、A1组比较t=6.93，P<0.01；A、B组比较t=2.26，P>0.05。12周后A、A1组比较t=5.40，P=0.01；B、A1组比较t=5.96，P<0.01；A、B组比较t=1.23，P=0.15。

a A组6周切片 b A1组6周切片

a A组12周切片 b A1组12周切片

a B组6周切片 b B组12周切片

A、B组毛细血管数量、腱-骨长入厚度显著高于A1组(P<0.01，见表3～4)。6周后A、A1组比较，t=11.49，P<0.01；B、A1组比较t=13.19，P<0.01；A、B组比较t=1.23，P=0.15。12周后A、A1组比较t=11.89，P<0.01；B、A1组比较t=12.01，P<0.01；A、B组比较t=1.69，P=0.09(见图4～7)。

2.3 BMP和bFGF染色IOD值测定 比较发现A、B组6周时BMP和bFGF染色IOD值显著高于A1组(P<0.01)，A、B两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。12周时A、B组IOD仍高于A1组(P<0.05)，A、B两组间比较差异无统计学意义(见表5～6)。BMP染色IOD值：6周A、B组比较，t=0.751，P=0.47；B、A1组比较，t=29.371，P<0.01；A、A1组比较，t=28.268，P<0.01。12周A、B组比较，t=-1.322，P=0.22；B、A1组比较，t=7.398，P<0.01；A、A1组比较，t=5.774，P<0.01。bFGF染色IOD值：6周A、B组比较，t=0.226，P=0.83；B、A1组比较，t=9.296，P<0.01；A、A1组比较，t=9.357，P<0.01。12周A、B组比较，t=0.674，P=0.52；B、A1组比较，t=5.622，P<0.01；A、A1组比较，t=5.243，P<0.01。

表3 3组腱-骨止点细胞密度比较

表4 3组腱-骨长入厚度对比

图4 3组成熟骨细胞计数比较

图5 3组骨母细胞计数比较

图6 3组毛细血管数量比较

图7 3组腱-骨长入厚度比较

表5 BMP染色IOD值

表6 bFGF染色IOD值

2.4 生物力学测试 B1组不能进行力学测试，予以剔除。6周样本中抗拉强度正常对照组>A=B>A1；12周后抗拉强度正常对照组>A>B>A1组(见表7，见图8)。最大载荷：6周A、A1组比较，t=7.38，P<0.01；B、A1组比较，t=7.22，P<0.01；A、B组比较，t=0.18，P=0.35。12周A、A1组比较，t=13.45，P<0.01；B、A1组比较，t=4.99，P<0.01；A、B组比较，t=8.12，P<0.01。腱-骨结合部面积：6周A、A1组比较，t=1.96，P=0.07；B、A1组比较，t=1.58，P=0.10；A、B组比较，t=0.79，P=0.24。12周A、A1组比较，t=4.69，P<0.01；B、A1组比较，t=6.05，P<0.01；A、B组比较，t=1.95，P=0.07。抗拉强度：6周A、A1组比较，t=12.21，P<0.01；B、A1组比较，t=15.22，P<0.01；A、B组比较，t=1.07，P=0.18。12周A、A1组比较，t=20.31，P<0.01；B、A1组比较，t=2.93，P=0.03；A、B组比较，t=27.69，P<0.01。

图8 3组抗拉强度对比分析

表7 3组腱-骨止点生物力学对比

3 讨 论

3.1 游离骨膜瓣对骨缺损愈合的影响 从表2可见，A、B两组缺损处的骨愈合速度、骨缺损愈合率远高于A1、B1组，带血供的骨膜能有效修复小段骨缺损。考虑骨内膜为缺损部提供了大量的间充质细胞，间充质细胞分化为骨母细胞，骨母细胞分泌基质，促进钙沉积。而带血管蒂的骨膜瓣具备完整的动脉供血系统及静脉回流系统，血供充足，局部氧分压高；在用骨膜包裹肌腱、缺损部缝合时使其成为高张力状态；良好血供、高氧分压与高张力因素促进骨母细胞向成熟骨细胞分化[2，3-4]，修复骨缺损。

3.2 游离骨膜瓣和内植物对腱-骨止点骨细胞、骨母细胞数量的影响 腱-骨愈合有直接愈合和间接愈合两种方式[5]，直接腱-骨愈合是形成具有4层“潮线”结构特点的腱-骨连接，而间接愈合是肌腱-骨之间被大量肉芽、成纤维组织包裹，最后改造、塑性形成Sharpey样纤维而达到连接[6-7]，但该类愈合时间很长，有报道需要12个月以上[8]。直接愈合与局部成熟骨细胞数量密切相关，只有成熟骨细胞才能形成钙质，为肌腱附着提供坚强的“锚定界面”[9-10]。骨母细胞体积较小，位于骨质表面，可分化为体积较大、染色较深的成骨细胞，成熟骨细胞分泌基质和纤维并逐渐被骨质包裹，移行于其中。由表3及图4～5可见，A组成熟骨细胞数量始终多于其他组，6周A组骨母细胞与B组比较差异无统计学意义，12周则明显少于B组，说明B组骨母细胞在继续分化为骨细胞时受阻。考虑是因为A组中骨母细胞微环境合适，骨母细胞更易于在周围沉积钙质和胶原并向成熟骨细胞转化；而B组骨膜瓣血供虽良好，但钛板表面环境阻碍了骨母细胞分泌基质、钙沉积过程，抑制了骨母细胞向骨细胞转化，故而引起骨母细胞数量随时间推移逐渐增多，骨膜增厚，骨细胞数量却极少。我们分析，对骨膜不能在钛内植物表面成骨的机制不完全明了，可能与下列因素有关：(1)钛板光滑的表面不能为增殖的骨细胞提供黏附的空间支架结构，骨细胞在有限的空间增殖后抑制了骨膜间充质细胞向骨细胞转化。(2)普通钛内植物表面不能形成富含各种成骨生长因子的微环境。(3)钛的组织相容性强，对机体刺激性小，引起的局部炎性反应弱，局部各种炎性因子含量低，而炎性因子能影响多种骨生长因子的分泌。本次实验给予的腱-骨愈合时间较短，文献报道完全形成骨性愈合时间需6～12个月[7，11]，因此未观察到腱-骨连接复合体。但对比未用骨膜覆盖的A1组，游离骨膜移植可显著增加成熟骨细胞数量，加快钙质形成速度。B组的实验结果一方面证明了附着界面对腱止点愈合的重要性，同时也证明了游离骨膜能够与肌腱形成间接连接，能达到间接愈合。

3.3 游离骨膜瓣对腱-骨止点血供建立及腱-骨长入厚度的影响 重建良好的血液供应对促进腱-骨愈合非常必要[12]。丰富的毛细血管网提供给肌腱残端良好血供，有助于肌腱末端血供系统再生，从而促进腱组织的“自愈合能力”[13]。表2中通过毛细血管计数对比发现，带骨膜瓣的A、B组对恢复重建止点部位微循环有显著促进作用。B1组实验结果表明，单纯依靠肌腱的“自愈合能力”不能在3个月的时间内形成腱-内植物的有效连接，肌腱短期内即可因腱远端坏死而使重建失败，也不能依靠周围的软组织重建局部循环。

腱-骨长入厚度是评价腱-骨愈合程度及影响腱-骨愈合强度最重要的指标之一[14]。包裹肌腱止点的成骨细胞使腱-骨止点有充分的接触面积，肌腱和骨组织更易于相互长入，此过程被学者称为“腱-骨整合过程”，是腱-骨坚强愈合过程的重要一步[15]。A组12周时已可见部分腱-骨组织重塑，而腱-骨愈合的本质，就是肌腱与骨组织各种因素作用下相互长入、重塑，形成牢固纤维连接或骨性连接的过程。对骨膜的张力性缝合起到了细胞支架作用，使新生骨及肌腱能够通过支架生长，恢复了骨缺损原有腱-骨解剖结构。

3.4 游离骨膜对细胞因子BMP、bFGF的影响 已证实BMP和bFGF有诱导局部未分化细胞向成骨细胞或成软骨细胞转化，加强成骨细胞功能的作用[16-17]。表5～6可见A、B组上述两组细胞因子的表达对比A1组差异有统计学意义。其来源为：(1)游离骨膜本身就具有完整的血供系统，含毛细血管网、纤维结缔组织和成纤维细胞，bFGF即由成纤维细胞分泌。(2)游离骨膜促进了肌腱断端毛细血管网的重建，损伤的肌腱细胞和腱鞘中的成纤维细胞也大量分泌bFGF。(3)止点周围肉芽组织分泌bFGF。(4)游离骨膜中的多功能间充质细胞分化为骨细胞或软骨细胞，BMP主要由骨细胞、骨母细胞和软骨细胞分泌。分泌的BMP促进更多骨细胞成熟，其含量进一步增多[18-19]。(5)骨膜细胞自身表达BMP。

正常骨组织并不表达BMP，一旦骨组织损伤，骨细胞中BMP被迅速激活，参与骨修复，一旦修复完成，则其表达再次静止[20]。这也解释了A、B组在12周后样本中BMP含量较6周时降低的现象。与BMP相似，bFGF含量也在修复完成后逐渐下降。A1组中因为修复未完成，BMP和bFGF持续表达，含量逐渐增高。

3.5 游离骨膜对腱-骨生物力学的影响 对各组的生物力学测试结果发现，6周时A、B组最大载荷和抗拉强度无明显差别，均为正常空白对照组的37%左右，而12周后A组明显高于B组，说明后期随着A组骨、腱组织的重塑改建完成，直接愈合的强度优于间接愈合，能在更早时间内接受更大的功能活动锻炼。正常的腱-骨骨性连接所具备的腱组织-非钙化软骨-钙化软骨-骨复合结构是一个逐层缓冲结构，能够将应力逐层分散递减承担，避免了应力集中而使得腱-骨止点承受更大拉力，完成直接愈合达到正常腱-骨止点强度的过程需要长于24周的时间[20-21]。有文献报道骨性腱-骨愈合过程中典型“潮线”结构形成时间需1年左右，同时肌腱完全韧带化的时间需10余月[22]，A组肌腱止点虽然被骨性组织包裹，并在其中长入、重塑，但并未达到完全愈合时间，因此A组腱-骨愈合强度弱于正常对照组。12周后B组抗拉强度为正常47%，高于A1组35%，比较后证明，即使单纯利用带血管游离骨膜通过间接连接方式修复腱-骨止点的抗拉强度，也优于使用传统修复方式的A1组。间接腱-骨愈合的标志是形成Sharpey样纤维，此结构能够有效将应力分散到骨面上，以对抗更强的拉力，但其过程也耗时颇长，有的实验甚至在14个月后才观察到该纤维形成[23-24]，但通过该实验证明游离骨膜能为腱-骨间接愈合提供更有利的条件。

综上所述，针对关节周围腱-骨缺损修复目前的常用方法为游离骨移植修复骨缺损，再行腱-移植骨止点重建。但其缺陷显而易见：操作步骤增多导致手术时间长、感染概率增大、手术创伤增加、供区骨组织永久缺损等。因此，寻找一种新的修复重建方法成为大家关注的热点。利用带血管系统的游离骨膜直接修复关节周围的骨缺损并同时重建腱-骨、腱-假体止点的相关研究较少，尤其是在重建后对其生物力学的研究方面。在实验动物学方面，选择兔肱二头肌肌腱桡骨止点模拟腱骨止点缺损并利用带尺动脉游离骨膜瓣修复的建模方法也未见相关文献报道。本实验利用带血管骨膜重建关节周围骨缺损部位腱-骨、腱-假体止点的实验研究有极强的临床针对性，在关节外科、创伤骨科及运动医学领域有应用价值，为临床骨缺损修复，重建腱-骨、腱-假体止点提供了一种新的治疗选择。