一例草鱼肌肉出血病的病原学分析

张 超

(重庆三峡职业学院，重庆 万州 404155)

【研究意义】草鱼(Ctenopharyngodonidellus)是“四大家鱼”之一，具有肉味鲜美、营养价值高、饲料来源广泛、市场价格稳定等特点，深受养殖户和水产消费者的欢迎[1-2]。草鱼是中国养殖产量最高、养殖范围最广的养殖品种，据《2019中国渔业统计年鉴》，2018年草鱼的养殖产量达到550.43万吨[3]。随着集约化养殖水平的提高，各种病害频繁发生，严重影响了草鱼产业的健康发展，病害已经成为关系草鱼养殖成败的瓶颈。因此，分离鉴定病原并采取有效的防治显得尤为重要。2019年4月上旬，重庆万州某养殖场出现草鱼死亡病例，流行病学特征和临床症状与已报道的草鱼的病害差异较大[4]，亟需开展系统的病原分离鉴定。【前人研究进展】对草鱼为害较大的常见病为草鱼出血病、细菌性烂鳃病、赤皮病、肠炎和细菌性败血症[4-5]。仅有草鱼出血病能引起肌肉出血症状，但是，本文病例的流行病学特征和其他临床症状与草鱼出血病不符[4-5]。鲁氏耶尔森菌(Yersiniaruckeri)是冷水性鲑科鱼类的常见致病菌，典型症状为口腔出血和肠炎。该菌对大部分养殖的鲑鳟鱼类都具感染性，并且能引起温水性鲤科鲢、鳙鱼发病[6]，但未见有侵染草鱼的病例报道。【本研究切入点】该病发病急，3日累计死亡率达10 %。典型症状表现为口腔点状出血、肌肉出血、肠外壁点状出血、鳔出血，脾脏呈酱紫色。发病日平均气温为22 ℃，病鱼平均规格115 g，3日内死亡量从开始的2～3尾增加到200多尾，病程持续1周，累积死亡率30 %左右，流行病学、临床症状与已报道的草鱼其他疾病存在明显差异。【拟解决的关键问题】对重庆万州某养殖场患肌肉出血症的草鱼进行病原菌分离鉴定和药敏试验，阐明发病原因，为该病的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

患病草鱼取自重庆市万州区某养殖场，健康草鱼购自当地水产品市场，规格大致与发病鱼相同，暂养7 d后，随机挑选进行回归感染试验。TSA培养基、革兰氏染色液、药敏检测试剂盒、细菌微量生化鉴定管均购于杭州天和微生物试剂有限公司；RNA提取试剂盒、细菌基因组DNA 提取试剂盒、DNA回收试剂盒和DNA Marker购于宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 草鱼呼肠孤病毒检测

具体操作方法参考曾伟伟等[5]草鱼呼肠孤病毒三重PCR检测。

1.3 细菌分离与纯化

将患病鱼体表面用75 %酒精消毒，无菌操作取脑、肝、脾、肾划线接种于TSA琼脂平板上。培养基倒置于28 ℃恒温培养箱中培养24～48 h[6]。选择菌量较多、形态颜色一致的菌落，挑取单个菌落进一步划线培养[6]。纯化后的菌株转移到TSA琼脂固体斜面培养基上，置4 ℃冰箱保存备用[6]。革兰氏染色参照文献[7]的方法进行，光学显微镜下观察细菌形态。

1.4 细菌生理生化试验

参照细菌生化微量鉴定管说明书和《常见细菌系统鉴定手册》[7]对病原进行鉴定。

1.5 细菌16S rDNA基因序列分析

使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取待检菌株的DNA。16S rDNA基因PCR扩增引物参照分支杆菌[8]，反应条件略有改动。正向引物为：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC-3′；反向引物为：5′-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3′。PCR反应体系总量为50 μl，具体组成为：10×PCR缓冲液5 μl，MgCl2(25 mmol/L)5 μl，dNTP(10 mmol/L)0.8 μl，正向引物和反向引物(20 μmol/L)各0.5 μl，TaqDNA聚合酶(5 U/μl)1.2 μl，DNA模板5 μl，用无菌双蒸水补足。PCR反应条件为：94 ℃预变性10 min，接下来94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30个循环，72 ℃ 10 min。PCR产物用1.0 %的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，胶回收后克隆到T载体上，送至上海生物工程有限公司进行测序。用NCBI-Blast进行在线序列比对，用ClustalX 1.81进行多重序列匹配和聚类分析，用Mega 4.0构建系统发育进化树。

1.6 回归感染试验

将市场上购买的健康草鱼分成两组，每组20尾，调整菌悬液浓度为4×107cfu/mL，攻毒组每尾胸鳍基部注射0.2 mL菌液，对照组注射0.2 mL的生理盐水。将试验鱼放置于水温为22～25 ℃的养殖箱中，每天观察并记录鱼的发病和死亡情况，持续时间为2周。同时对濒临死亡或已死亡的鱼进行剖检和病原菌的再次分离鉴定。

1.7 药敏试验

药敏试验采用纸片扩散法。取浓度为1.5×107cfu/mL的菌液0.2 mL均匀涂布于TSA琼脂培养基平板上，28 ℃恒温培养箱中倒置培养24 h后观察并记录抑菌圈的直径，敏感性判定参照试剂盒说明书。

2 结果与分析

2.1 发病草鱼特点及临床症状

气温骤然升高后发病，发病日平均气温22 ℃，病鱼平均规格115 g，3 d内死亡量从开始的2～3尾增加到200多尾，病程持续1周，累计死亡率30 %左右。病鱼症状：运动能力差、体色异常、肌肉出血、鳍条基部出血、口腔广泛性点状出血，剖检可见脾脏淤血肿大，呈酱紫色，肾脏和肝脏充血肿大，肠壁点状出血，鳔出血(图1)。

2.2 发病草鱼呼肠孤病毒检测

采用3种不同基因型的草鱼呼肠弧病毒引物进行PCR检测，结果均为阴性。草鱼出血病的流行水温为27～30 ℃，“红肌肉型”多发于5～10 cm的草鱼鱼种，结合草鱼呼肠孤病毒的流行病学和该病例的发病特点，可以排除草鱼呼肠孤病毒感染。

A为肌肉出血、鳔出血；B为口腔点状出血A. Muscle and bladder bleeding, B.Pointed oral bleeding图1 病鱼临床症状Fig.1 Clinical symptoms of diseased fish

2.3 病原分离株的形态特征

病原分离株的菌落形状为圆形，表面光滑，边缘平滑无凹凸，直径大小约为1 mm，白色略透明。革兰氏染色阴性，短状杆，两端呈圆状，个别菌体相互连接成细丝状(图2)。

图2 病原分离株的革兰氏染色(×100)Fig.2 Gram staining of the isolate(×100)

2.4 病原分离株的生理生化特征

分离菌株在温度18～36 ℃均能生长，最适宜生长温度为24～31 ℃；在pH值4～10均能生长，最适生长的pH值范围为5～8。细菌有运动性，硫化氢反应、V-P反应阴性，能发酵葡萄糖、果糖、麦芽糖。具体生理生化特征见表1，对照株参照范方玲等[9]。

表1 分离菌株的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of the isolate

2.5 病原分离株的16S rDNA基因序列分析

引物扩增分离株的16S rDNA，获得长度为1509 bp的特异性条带(图3)。通过NCBI-Blast同源性比对，发现病原菌的16S rDNA基因与鲁氏耶尔森菌的同源性达99 %。从GenBank数据库中下载相关序列，用ClustalX 1.81对序列进行校正，采用Mega 4.0构建系统发育树，结果显示病原菌与鲁氏耶尔森菌聚为一支(图4)。

2.6 健康草鱼人工感染试验

试验组草鱼在人工感染2 d后，出现活力下降，游动无力现象，鳍条基部开始有出血点呈现，口腔有斑点状出血点，7 d内发病草鱼占攻毒草鱼总数的70 %，而注射无菌生理盐水的对照组未见异常(表2)。

表2 人工感染后草鱼发病和死亡结果Table 2 Data about disease and death of grass carp after artificial infection

M为2000 DNA Ladder;1为分离株16S rDNAM=2000 DNA Ladder;1=16S rDNA of the isolate图3 病原分离株的16S rDNA基因序列扩增电泳图Fig.3 Electrophoresis of 16S rDNA of the isolate after being amplified by PCR

LY1904为分离株，细菌种名后的序号为 GenBank 登录号LY1904 is the isolate. Serial numbers after the species name are GenBank accession number图4 病原分离株的16S rDNA基因序列系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of the isolate based on 16S rDNA sequence

剖检可见肠道斑点状出血，鳔表面出血，与自然发病的草鱼症状相似。再次分离到的菌株与原代菌株形态，生理生化性质和16S rDNA序列分析一致，表明分离株为该病例的致病病原。

2.7 病原分离株的药敏试验

分离菌株对36种抗菌药的敏感性表现：对青霉素G、苯唑西林、利福平、万古霉素、克拉霉素、红霉素、头孢他啶、麦迪霉素、痢特灵存在耐药性，对氨苄西林、恩诺沙星、氟苯尼考等19种抗菌药敏感(表3)。

表3 病原分离株的药敏试验结果Table 3 Antibiotic sensitivity test of the isolate

3 讨 论

该草鱼病例的典型症状为肌肉出血，发病水温为17～22 ℃，疑似肌肉出血型草鱼出血病，但是流行病学特点与草鱼出血病不符[10]，通过草鱼呼肠孤病毒三重PCR检测也排除了病毒感染的可能，亦未见明显的寄生虫侵袭。从病鱼的脑、肝、肾和脾中均分离到单一的菌落特征相同的革兰氏阴性细菌，其形态和理化特征均与鲁氏耶尔森菌较为符合[9, 11-13]。分离菌株经16S rDNA PCR扩增和序列测定，得到的片段大小为1509 bp，通过BLAST比对，与鲁氏耶尔森菌的同源性最高，达99 %，人工感染试验与自然发病的症状一致，表明鲁氏耶尔森菌为该病例的致病病原。

鲁氏耶尔森菌属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)耶尔森氏菌属(Yersinia)，冷水性鲑鳟鱼类为易感品种，典型症状为肠炎和“红嘴”，常引起重大经济损失[14-17]。该病菌20世纪50年代首次分离自美国爱达荷州的养殖虹鳟(Oncorhynchusmykiss)，当前主要流行区域为加拿大、欧洲、美国南部、中东、中国、印度和澳大利亚，侵染鱼类包括鲑鳟科鱼类、鲤鱼(Cyprinuscarpio)、鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙(Aristichthysnobilis)、鲟鱼(Acipenseriformes)、斑点叉尾鮰(Ictalunespunctatus)等，已成为养殖鱼类主要病原菌之一[13, 18-21]。本研究首次从中国的养殖草鱼病例中分离到一株鲁氏耶尔森菌，发病症状和鲢、鳙较为相似，呈现典型的败血症症状，早期资料认为鲁氏耶尔森菌是淡水鱼类细菌性败血症的主要病原[15]，本文的研究数据也证实了这一点。该病例还表现为肌肉出血，与草鱼出血病症状较为相似，典型区别为前者肌肉呈暗红色，后者呈鲜红色，临床上应结合流行病学特征进行鉴别诊断[10, 15]。

本研究首次从中国的养殖草鱼中分离到致病鲁氏耶尔森菌，分离株对36种抗菌药的敏感性结果为该病的临床防治提供了参考。该菌对恩诺沙星、氟苯尼考、环丙沙星敏感，这与范方玲等[9]和方苹等[11]

的报道相同，与斑点叉尾鮰鲁氏耶尔森菌[11]对卡那霉素的敏感性有很大的差异，这种差异可能是由菌株自身引起，也可能是养殖过程中使用可诱导菌株产生耐药性的药物所致[22-25]。总的来说，对鲁氏耶尔森菌病的治疗应采用恩诺沙星和氟苯尼考等水产常用抗菌药，笔者临床采用氟苯尼考对该病例进行治疗，获得了较好的效果。该病发生的起始因素是水质恶化，生产中应定期对养殖水体进行养护，同时严格执行标准化饲养管理，才能从根本上预防该病的发生。

4 结 论

通过系统的病原分离鉴定，确定引起该例草鱼肌肉出血病的病原为鲁氏耶尔森菌。鲁氏耶尔森菌是冷水鱼的主要致病菌，本研究首次从中国的养殖草鱼中分离到致病鲁氏耶尔森菌，该菌对青霉素G、苯唑西林、利福平、万古霉素、克拉霉素、红霉素、头孢他啶、麦迪霉素、痢特灵存在耐药性，对氨苄西林、恩诺沙星、氟苯尼考等19种抗菌药敏感，可选用恩诺沙星、氟苯尼考等水产类常用抗菌药进行防治。