中国美利奴羊(新疆军垦型)胎儿期皮肤毛囊结构及形态学观察

杨涵羽璐，杨永林，方晨辉，杨 华*，沈 敏，杨井泉，高 磊

(1.新疆农业大学动物科学学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2. 省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室，新疆 石河子 832000；3. 新疆农垦科学院畜牧兽医研究所，新疆 石河子 832000；4. 塔里木大学动物科学学院，新疆 阿拉尔 843300)

【研究意义】毛囊是皮肤重要的附属器官，是羊毛生长发育及羊毛品质的基础，毛囊发育影响着细度、密度、强度和长度等羊毛重要的经济性状，决定羊毛的质量。【前人研究进展】研究表明，毛囊由8个独特的细胞群构成，是哺乳动物中最典型也是最复杂的微小器官之一，也是哺乳动物唯一具有生命周期的生长器官[1-4]。毛囊发育始于胚胎期的外胚层和中胚层，胎儿期的毛囊发育对出生后的羊毛发生、发育都有影响。因此，研究胎儿期毛囊发育的形态特征与分化结构变化可为细毛羊的选育奠定基础。毛囊发育中，许多信号通路相互作用参与了毛囊周期交替，真皮和表皮细胞群之间相互作用产生了毛囊[5]。毛囊在胚胎发育后期发生，不同毛囊的功能和基因表达不同，毛囊分为初级毛囊(PF)和没有汗腺的次级毛囊(SF)，次级毛囊决定羊毛品质和产量[6]。Galbraith和Rogers研究发现，在绵羊胚胎发育50 d左右时，皮肤逐渐开始形成初级毛囊，次级毛囊在胚胎发育到85 d时开始出现，到羔羊出生时，所有毛囊都已形成，初级毛囊虽然都已经成熟，但次级毛囊尚未成熟[7-8]。中国超细毛羊(甘肃型)在胎儿期84 d时初级毛囊在皮肤一侧开始发生[9]。【本研究切入点】中国美利奴羊(新疆军垦型)是利用澳洲美利奴公羊作为父本，波尔华斯羊与新疆细毛羊作为母本，采取级进杂交的方法于1972年在新疆紫泥泉种羊场培育成功。该品种羊毛的毛丛结构闭合良好，各部位毛纤维长度与细度均匀，羊毛细度为60～64支以上，所产的羊毛是经济价值非常高的天然纺织原料。而针对中国美利奴羊(新疆军垦型)初级毛囊和次级毛囊发育的时间点及形态变化特征报道较少。【拟解决的关键问题】本文研究中国美利奴羊(新疆军垦型)11个胎儿期毛囊发育形态结构变化与发育规律，分析毛囊特征参数与毛性状间的相关性，为优质超细毛羊的培育工作提供基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物

选择新疆农垦科学院种羊场50只2.5岁健康的中国美利奴羊(新疆军垦型)经产母羊(平均羊毛纤维直径为17.5±0.5 μm)，在相同的饲养管理条件下喂养，严格执行防疫和驱虫。根据种羊系谱信息，应用同品种的种公羊(平均羊毛纤维直径16.6±0.5 μm)配种，准确记录配种时间。采样时间从2017年9月15日至2018年3月1日，以胎儿发育的45 d开始，每10 d为1个采样期，分别为45 d(第1时期)、55 d(第2时期)、65 d(第3时期)、75 d(第4时期)、85 d(第5时期)、95 d(第6时期)、105 d(第7时期)、115 d(第8时期)、125 d(第9时期)、135 d(第10时期)和145 d(第11时期)，每个发育时期采集3只胎羊的体侧部皮肤组织，共33个胎儿，皮肤组织用1×PBS洗涤，放入4 %多聚甲醛保存，备用。

1.2 主要仪器设备

RM2235石蜡切片机(Leica，德国)，恒温水浴槽，石蜡包埋冷台(EG1130)，染片机(Leica CV5030)，自动封片机(Leica)，正置显微镜(Nikon)，切片架，烘干箱等。

1.3 主要试剂

试剂均为分析纯，无水乙醇、二甲苯、多聚甲醛、苏木素染液、伊红染液(北京索莱宝科技)；专用包埋石蜡(上海华灵)；中性树脂。

1.4 试验方法

1.4.1 石蜡组织切片制作 将采集的各个时期的皮肤组织修剪为1 cm2的小方块，用1×PBS冲洗，然后放入4 %多聚甲醛内固定 24 h 以上。将固定好的组织块修整后，用1×PBS缓冲液冲洗，经过不同浓度乙醇梯度脱水。用二甲苯透明处理，浸蜡，石蜡包埋。将包埋好的蜡块放到切片机上，根据毛囊生长方向，切为5 um的横切和纵切组织切片，随后用烘片机烘干切片的水分，固定1 h后取出，放在切片架上37 ℃干燥。应用苏木精和伊红进行HE染色。

1.4.2 统计方法 在显微镜下观察皮肤毛囊组织切片，根据切片比例尺计算视野面积，计算总毛囊数、初级毛囊密度、次级毛囊密度、次级毛囊密度/初级毛囊密度比值(S/P)。用SPSS24.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 胎儿皮肤发育变化

从图1-A～B可见，毛囊在胚胎时期开始形成，从毛囊原始体发育形成一套完整的不断产生羊毛纤维的毛囊组织，毛囊和胎儿皮肤细胞同时发育。胎儿45～55 d是皮肤发育的时期，皮肤明显地分为表皮层、真皮层、皮下结缔组织3层。

2.2 毛囊形态发生变化

从图1-C～K可见，在胎儿发育65 d时，出现毛囊原始体，随着细胞大量增殖，在毛囊原始体的部位出现一个囊泡，然后开始向真皮层伸入生长。到胎龄85 d时，毛囊从真皮层一直延伸到皮下结缔组织。汗腺和皮脂腺等附属物也逐渐形成，开始出现立毛肌的组织。管状物中充满了生长细胞，形成毛原锥体，其一侧出现皮脂腺和汗腺，汗腺向下直达皮肤最下层。立毛肌发育成熟，一端连接在发生发层上，另一端深入毛囊下部。管状下端与毛乳头相联结，细胞不断增殖而膨大，包围毛乳头，形成毛球。次级毛囊开始发生，排列在初级毛囊周围(图1-E)。原始次级毛囊(SO)在初级毛囊(PF)附近以及初级毛囊之间开始形成。胎龄105 d时，次级毛囊和初级毛囊之间派生出再分化次级毛囊(SD)。毛纤维最后穿过表皮伸出体外，形成毛管(图1-G)。初级毛囊周围会出现原始的次级毛囊和再分化次级毛囊，形成线性三毛囊群(PLX)(图1-H)。从115～145 d毛囊的横切面可以看出，皮脂腺和汗腺都可以与中央毛囊群(PCX)相关联。最早发育的次级毛囊出现在离初级毛囊最远的毛囊群周围，而最近的次级毛囊往往出现在中央初级毛囊之间。

A:胎儿期45 d(400×)； B：胎儿期55 d(200×)； C：胎儿期65 d(200×)； D：胎儿期75 d(200×)； E：胎儿期85 d(200×)； F：胎儿期95 d(400×)； G：胎儿期105 d(100×)； H:胎儿期115 d(100×)。a1:表皮；a2：皮下结缔组织；b1：表皮；b2：真皮；b3：皮下结缔组织；c：囊泡；d：毛芽；e1：初级毛囊；e2：次级毛囊；f1：毛球 f2：初级毛囊；f3：次级毛囊；g1：毛管；g2：外根鞘；g3：毛干；g4：真皮毛乳头；h1：连接组织鞘；h2：真皮毛乳头；h3：毛球；h4：再分化次级毛囊A：45 days of fetal period(400×); B: 55 days of fetal period(200×); C: 65 days of fetal period(200×); D: 75 days of fetal period(200×); E: 85 days of fetal period(200×); F: 95 days of fetal period(400×); G: 105 days of fetal period(100×); H: 115 days of fetal period(100×). a1: Epidermis; a2: Subcutaneous connective tissue; b1: Epidermis; b2: Dermis; b3: Subcutaneous connective tissue;c: Epidermis plug; d: Hair germ; e1: Primary follicle; e2: Secondary follicle; f1: Hair bulb; f2: Primary follicle; f3: Secondary follicle;g1: Hair canal;g2: Outer root sheath; g3: Hair shaf; g4: Dermal papilla; h1: Connective tissue sheath; h2:Secondary follicle; h2: Dermal papilla; h3: Hair bulb; h4: Re-differentiation secondary follicle图1 11个胎儿期皮肤毛囊形态发生变化(纵切)Fig.1 Morphology changeable process of skin hair follicle in 11 fetal periods

2.3 毛囊密度与S/P值计算

通过胎儿期85～115 d横切切片图(图2)可见，随着次级毛囊的发生，原始次级毛囊会再分化次级毛囊，次级毛囊数量越来越多，再分化次级毛囊会决定后期毛囊数目，继而影响毛性状经济价值。随着毛囊发育毛囊会逐渐增大。进一步统计次级毛囊与初级毛囊密度，表1为统计分析的胎儿期85～145 d毛囊密度及S/P值，可见初级毛囊密度随着胎龄的先增加后减小，初级毛囊密度在95 d最大。

表1 胎儿期85～145 d毛囊密度及S/P值Table 1 Hair follicle density and S/P ratio from 85 to 145 days fetus

次级毛囊密度随着胎龄的增长也呈先增加后减小，次级毛囊密度在115 d最大。次级毛囊数量/初级毛囊数量(S/P)值随着发育阶段逐渐增大，在135 d时S/P值达到最大值4.45。

3 讨 论

毛发是哺乳动物的典型特征，具有调节体温、保护和伪装等功能。毛发是由皮肤的外胚层分化形成，此外还形成了皮脂腺、汗腺和指甲等附属物结构[5]。对于绵羊来说，除了提供保护，羊毛也有感官功能，在皮肤水平上延伸触觉的发生[10]。羊毛是一种重要的动物产品，是纺织工业的原材料。羊毛的质量取决于它的纤维直径(细度)、卷曲度、长度、颜色等。其中，纤维直径是决定羊毛品质和价格的最重要因素。作为羊毛生长的直接器官，毛囊对生产优质羊毛起着至关重要的作用，而且毛囊能够在不同季节改变类型和密度[11]。羊毛次级毛囊的生长周期和复杂的结构影响羊毛的生长发育和羊毛品质。

许多研究人员对毛囊形态学进行了研究，许竟武等通过组织切片证实湖羊在胎龄66 d时体侧部出现初级毛囊原始体，到胎龄95 d时发育完全，此时次级毛囊原始体才开始出现，到132 d 时初级毛囊和次级毛囊均已发育完全[12]。滩羊在45～50 d胎儿期的时候头部毛囊原始体开始出现，60 d时毛囊原始体开始发展到全身，到105 d时毛纤维已生长出体外[13]。苏博美利奴羊皮肤初级毛囊约在胚胎 50～55 d 开始形成，胎龄 65～75 d 是初级毛囊形成的重要时期，胎龄 80～85 d 是次级毛囊形成期，胎龄 105～135 d 是次级毛囊大量再分化时期[14]。

Gao等通过对绒山羊毛囊形态学变化表明，初级毛囊在胎龄60 d开始发育，到胎龄120 d成熟，而在胎龄120 d鉴定出次级毛囊的分化，直到出生后羊毛形成[15]。张燕军等通过观察内蒙古阿尔巴斯绒山羊胚胎皮肤组织切片，发现绒山羊的毛囊由连接组织鞘(CTS)、外根鞘(ORS)、内根鞘(IRS)、毛球和毛干等组成，在胎龄55～65 d时，毛芽开始形成，胎龄135 d时，大多数初级毛囊和一部分次级毛囊分支发育基本成熟[16]。阿拉善绒山羊胎儿皮肤石蜡切片观察表明，胎儿期45 d时初级毛囊发生，75 d时次级毛囊发生，同时皮脂腺和汗腺等附属物出现，竖毛肌在90 d出现，初级毛囊在胎儿135 d时发育完成，次级毛囊到出生后6月龄发育完成。林吉茂等运用HE和Masson染色法以及透射电镜观察不同发育时期的山羊胎儿皮肤组织切片，结果显示，胎龄8～9周表皮开始发育，10周胎龄真皮层开始出现，11周胎龄原始毛囊出现，12～13周胎龄表皮细胞出现角质层、透明层及颗粒层的分化，汗腺开始出现；14～15周胎龄毛球上皮细胞开始分化为外根鞘、内根鞘和毛发的前体，在毛囊旁可见附属物皮脂腺；16～17周胎龄毛开始形成，并随着发育逐渐长出体表；18周胎龄皮肤结构逐渐趋于成熟[17]。以上研究结果说明，绵羊的初级毛囊原始体在胎龄45～66 d出现，胎龄 65～75 d是初级毛囊形成期，胎龄 80～95 d 是次级毛囊形成期，胎龄 105～135 d 是次级毛囊再分化时期。

山羊的初级毛囊原始体在胎龄45～65 d出现，胎龄60～75 d是初级毛囊形成期，胎龄75～135 d到是次级毛囊发育期，胎龄120 d到出生是次级毛囊再分化时期。可见，绵羊和山羊由于品种不同，毛囊发育节点差异较大。

本研究通过制作中国美利奴羊(新疆军垦型)胎儿期45～145 d皮肤毛囊不同发育时期的石蜡切片，分析皮肤毛囊发育的组织形态学特征，探究毛囊的发生及发育的细微过程。结果表明，皮肤结构在45～55 d逐渐发育完成，形成表皮层、真皮层、皮下结缔组织3层。

在胎儿发育过程中，毛纤维发育首先在皮肤的生发层出现一个结点，周围的血管为其输送血液和营养，细胞开始迅速分裂增殖，在65 d出现毛囊原始体，随着细胞大量增殖，毛囊原始体的部位出现囊泡，然后开始向真皮层伸入生长，初级毛囊开始发育。到胎龄85 d时，毛囊从真皮层一直延伸到皮下结缔组织，次级毛囊开始发育。胎龄105 d时，次级毛囊开始分化，出现再分化次级毛囊。毛球细胞持续增殖，管状边沿的细胞不断聚集而形成毛鞘，中间的则形成毛根，并开始角质化。毛鞘内的细胞急剧增殖，毛原锥体从毛鞘生长层连续的向上生长，而逐渐角质化。角质化后细胞形成的各种形状细胞，形成毛纤维。次生毛囊此时以形成了许多分支。新生的角质化细胞不断生长，新长成的羊毛纤维开始向上生长，加之有规律的毛囊周期性运动，毛纤维最后穿过表皮伸出体外，即形成了毛管。

115～145 d毛囊的横切面可以看出皮脂腺和汗腺都可以与中央毛囊群(PCX)相关联。尽管一些毛囊两个形成一对或保留为孤立的毛囊。因此，最早发育的次级毛囊出现在离初级毛囊最远的毛囊群周围，而最近的次级毛囊往往出现在中央初级毛囊之间。

本研究表明，中国美利奴羊(新疆军垦型)的毛囊原始体、初级毛囊、次级毛囊和再分化次级毛囊发育时间处于已报道的毛囊发育时间范围，而具体的发育时间差异可能是由于不同品种或者相同品种不同品系，以及生长环境、营养水平等原因导致结果不同。

次级毛囊数量/初级毛囊数量(S/P)的比值是反映羊毛纤维直径的重要指标。在细毛羊选育工作中，选择S/P值大的个体，不但能够使产毛量提高，还能够增加羊毛长度、减小羊毛细度，有助于同时提高产毛量和羊毛品质。史雷等通过制作陕北白绒山羊皮肤组织切片，观察皮肤毛囊形态特征，统计分析皮肤和毛囊的特征参数，S/P值与产绒量呈极显著正相关，与绒细度呈显著负相关，与绒长度呈显著正相关；次级毛球宽度与产绒量、绒长度呈极显著正相关[18]。澳大利亚美利奴羊的S/P高于中国超细毛羊(甘肃型)，然而中国超细毛羊(甘肃型) S/P值高于甘肃高山细毛羊[19]。中国超细毛羊(甘肃型)初级毛囊密度在胎龄87 d 时最大，随着胎龄的增加而逐渐减小；次级毛囊密度在胎龄87～117 d 时逐渐增加,在117 d时为(232.8±12.44)个/mm2达到最大值，然后逐渐减小，从138 d至出生时基本稳定；S/P 比值在87～126 d 时逐渐增大,在126 d时达到最大值9.96之后开始减小，到出生时基本稳定。本研究中S/P值随着胎龄的增加而逐渐增大，在135 d达到最大值，随后在145 d时出现一个下降。

综上所述，不同品种、同一品种不同品系、不同饲养条件、饲养管理、饲草料组成是造成的初级毛囊、次级毛囊和再分化次级毛囊发育时间，以及S/P值出现差异的原因。在细毛羊育种中，S/P值可以作为细毛羊选种工作中的一个重要性状指标，注重皮肤毛囊性状参数与产毛性状参数的相关性分析。

4 结 论

通过对中国美利奴羊(新疆军垦型)胎儿11个发育时期皮肤毛囊组织结构和形态学观察，胎龄 55 d时皮肤已经形成了完整的结构，毛囊原始体于65 d逐渐形成，初级毛囊开始发生的时期；胎龄85 d 次级毛囊开始发生。胎龄 105 d 时在原始次级毛囊开始再分化出次级毛囊。初级毛囊密度随着胎龄的增长而减小，次级毛囊密度随着胎龄的增长而增大。胎儿期85～145 d的S/P值随着胎龄的增加而逐渐增大。