藏猪和大约克猪CKM基因多态性及表达差异分析

巩兴龙，段梦琪，张 健，李雨晴，张芳芳，赵 雪，强巴央宗，商 鹏*

(1. 西藏农牧学院动物科学学院，西藏 林芝 860000；2. 黑龙江省大庆市杜尔伯特蒙古族自治县一心乡畜牧水产中心，黑龙江 大庆 163000)

【研究意义】动物产肉性能与肉品质一直以来都是广大育种工作者关注的热点，从分子水平研究猪肌肉组织生长发育调控机制将为育种工作提供新的突破口。肌酸激酶(CK)作为唯一的磷酸原激酶，是参与Cr+MgATP2-+ H+←→ PCr+MgADP-反应的关键酶[1-3]，主要为肌肉收缩及运动提供能量[4-6]。它有4 种同功酶形式，包括肌型 (MM-CK)、脑型 (BB-CK)、杂化型 (MB-CK) 和线粒体型 (Mi-CK/MtCK)[7]。其中CK肌型肌酸激酶(CKM)是一种组织特异性酶，存在于各种肌肉细胞中，参与细胞内的能量转运、肌肉收缩以及三磷酸腺苷的再生[8]。【前人研究进展】研究发现，CKM基因敲除小鼠的肌肉组织的ATP合成能力明显增强[9]。CKM基因主要在骨骼肌和心肌中高表达[10-11]，集中在M线附近[12]，在脑、肺和一些癌细胞中低表达[13]，而骨骼肌的发育与动物的产肉能力以及生长发育具有重要关联。有报道发现CKM基因在藏猪胚胎期背最长肌高表达，提出该基因与藏猪的慢生长和形态呈负相关[14]，意味CKM基因的高表达在藏猪中能抑制骨骼肌的生长发育以及降低藏猪的产肉能力。【本研究的切入点】本试验主要探究CKM基因在藏猪和大约克猪的多态性以及在不同组织的表达水平。【拟解决的关键问题】为进一步了解CKM基因在猪体内的调控机制奠定一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验选择西藏自治区林芝地区(海拔约2900 m)饲养的藏猪和大约克猪为研究对象。藏猪(TP)来源于西藏农牧学院藏猪养殖基地，大约克猪(YY)来源于林芝宇高生态农业开发有限公司养殖基地。共采集120 份耳组织(藏猪60 头，大约克猪60 头)，用于基因组DNA提取。选择6 月龄大小的藏猪和大约克猪(各8 头)进行屠宰，分别采集肝脏、背最长肌及背脂组织各2 份，立即放入RNA保存液，液氮速冻，-80 ℃保存，用于总RNA提取。

1.2 DNA、RNA以及cDNA的制备与提取

采用苯酚氯仿抽提法从耳组织中提取基因组DNA，用1 %琼脂糖凝胶电泳和Nano Drop2000分光光度计检测DNA浓度和质量，RNase-Free ddH2O溶解，-20 ℃保存。

利用RNA提取试剂盒(康为世纪生物科技有限公司，CW0584S)提取试验猪背最长肌、背脂和肝脏组织的总RNA。用Nano Drop2000分光光度计检测RNA浓度和质量，-80 ℃保存。

cDNA制备根据一步法cDNA Synthesis SuperMix试剂盒(北京天根生化科技有限公司，KR180123)进行反转录。合成体系见表1。

表1 cDNA第一链合成反应体系(20 μl)Table 1 System of cDNA first strand synthesis reaction

反应程序：温和吹打混匀，42 ℃延伸30 min，85 ℃保温5 min终止反应；cDNA保存在-20 ℃备用。

1.3 DNA引物设计与合成

从NCBI网站中下载CKM基因(登录号：NC_010448.4 )起始密码子上游约3 kb区域DNA序列。使用 Premier 5.0软件设计CKM基因的特异性引物，由上海生物工程有限公司合成，TE溶解，4 ℃保存。引物序列见表2。

表2 CKM基因 5’侧翼区引物序列Table 2 Primer sequence of CKM gene 5 'lateral region

1.4 定量PCR引物设计与合成

1.4.1 荧光定量PCR引物设计与合成 从NCBI网站中下载已知猪的CKM基因的mRNA序列，使用Premier 5.0软件设计荧光定量PCR扩增引物，以β-actin基因为内参基因，引物由上海生物工程有限公司进行设计合成，TE进行溶解，4 ℃保存，引物序列见表3。

表3 定量PCR引物序列 Table 3 Primer sequences for quantitative analysis

1.4.2 荧光定量结果计算方法 荧光定量PCR每个样品设置3 个重复，每个体系20 μl，含有1.0 μl cDNA，10.0 μl mix(Transgen)、7.8 μl ddH2O、正向和反向引物各0.6 μl(10.0 nmol/μl)。采用2-ΔΔCT方法计算CKM基因的mRNA水平。

ΔCT(样品)=CT(样品目的基因)-CT(样品内参基因)

ΔCT(标准样)=CT(标准样目的基因)-CT(标准样内参基因)

ΔΔCT=ΔCT(样品)-ΔCT(标准样)

目的基因表达量=2-ΔΔCT

1.5 转录因子预测

从GeneBank下载CKM基因具有显著突变位点的引物序列，利用在线软件CONSITE (http://jaspar.binf.ku.dk/)，选择脊椎动物，阈值设置80，把下载的突变前后的引物序列分别复制到软件上，SCAN来预测SNPs位点突变前后转录因子结合位点的变化。

1.6 统计分析

对个体测序测得数据结果，使用Chormas Pro软件对测序峰图进行分析，使用Excel软件计算各突变位点的基因频率和基因型频率，使用SPSS18.0软件进行χ2检验分析基因型分布和基因型频率的差异。对荧光定量结果，使用Excel进行初步整理，使用SigmaPlot 10.0制备图表，数据以“平均数±标准误”表示，P<0.01表示差异极显著，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 DNA提取结果

DNA提取结果显示所提取的样品DNA条带比较清晰，无拖尾现象和其它杂带的出现，未有蛋白质的污染，说明提取的DNA没有降解并且拥有良好的完整性，能够满下一步实验需求，检测结果见图1。

图1 猪基因组DNA凝胶电泳结果图Fig.1 Pig genomic DNA gel electrophoresis results

2.2 RNA提取结果

所提取的RNA经琼脂糖凝胶电泳检测发现，组织总RNA的28 S、18 S两条带比较清晰，无拖尾现象和其它杂带的出现，也未有蛋白质和DNA杂质的污染，说明各组提取的总RNA没有降解并且拥有良好的完整性，能够满足后续反转录和荧光定量的需要，检测结果见图2。

图2 组织总RNA琼脂糖凝胶电泳图Fig.2 Tissue total RNA agarose gel electrophoresis

2.3 SNP筛选与基因分型

藏猪、大约克猪混池测序结果见图3，在CKM基因起始密码子上游3 kb区域发现2 个C/T突变，位于起始密码子上游1185处和1324处，记为C-1185T和C-1324T。并对藏猪、大约克猪基因型频率和基因频率结果卡方检验进行基因分型，经检验CKM基因C-1185T和C-1324T位点均符合Hardy-Wein berg平衡(P>0.05)。基因型频率和基因频率及卡方检验结果见表4。

表4 CKM基因多态性位点基因型频率和等位基因频率Table 4 CKM gene polymorphism loci genotype frequency and gene frequency

图3 CKM基因SNPs位点测序峰图Fig.3 Sequencing chromatograms for the SNPs of CKM gene

2.4 CKM基因的mRNA表达

通过使用荧光定量PCR技术对CKM基因在藏猪和大约克猪各组织中的mRNA表达水平进行检测，结果显示：在3个组织中，CKM基因在藏猪背最长肌的表达量最高，其次是背脂和肝脏。其中，在背最长肌中，CKM基因藏猪表达量极显著高于大约克猪表达量(P<0.01)；在背脂中，CKM基因大约克猪表达量显著高于藏猪表达量(P<0.05)；在肝脏组织中，CKM基因藏猪表达量极显著高于大约克猪表达量(P<0.01)。

2.5 转录因子预测

对SNPS位点进行转录因子功能预测发现，CKM

*代表显著性差异(P<0.05)，**代表极显著差异(P<0.01)* Significant difference(P<0.05), ** Extremely significant difference(P<0.01)图4 CKM基因在TP、YY 2个品种猪背最长肌、背脂、和肝脏中mRNA的相对表达量Fig.4 Relative expression of CKM gene in longissimus dorsi,backfat and liver of TP and YY pigs

基因C-1185T位点突变前存在11 个转录因子，突变后存在10 个转录因子，其中6 个转录因子突变前后相同，较突变前5 个转录因子发生变化，新增4个转录因子Erg、EHF、ELK4和SPIB；C-1324T位点突变前存在6 个转录因子，突变后存在10 个转录因子，较突变前3 个转录因子没有发生变化，新增7 个转录因子TEAD1、En1、NFKB1、REL、FOXI1、Foxd3和Foxq1。

3 讨 论

CKM是哺乳动物细胞内表达的4 种肌酸激酶亚型之一 ，定位在6号染色体上，是肌肉发育和分化的标志[15]，是骨骼肌能量代谢的关键酶之一，是细胞生长信号途径中的重要成分。本研究在CKM基因起始密码子上游3000 bp区域中发现突变位点C-1185T和C-1324T，该单核苷酸多态性位点的基因型频率和基因频率在藏猪和大约克猪中存在极显著差异(P<0.01)。通过对这两个突变位点进行转录因子功能预测，发现新增的转录因子大多与细胞生长发育、分化和代谢以及肢体发育密切相关，如转录因子Erg、EHF和En1，转录因子Erg对于胚胎发育，细胞增殖、分化以及细胞凋亡机制的调控均有重要作用[16]，转录因子EHF广发存在于细胞核内，参与细胞增殖、分化、凋亡、衰老等过程[17]，转录因子En1与神经系统的发育有关，并在组织肌肉中持续表达[18]。揭示了这两个多态性位点可能与肌肉的生长发育相关。

本研究通过对藏猪和大约克猪的背最长肌、背脂和肝脏进行实时荧光定量检测，发现CKM基因在背最长肌中的表达最高，且CKM基因在背最长肌的表达水平显著高于背脂和肝脏组织。由此分析CKM基因在背最长肌中发挥重要作用。CKM基因在藏猪背最长肌中的表达水平极显著高于大约克猪(P<0.01)，推测CKM基因在藏猪背最长肌中的高表达可能会抑制藏猪的肌肉发育及体型生长。这与商鹏研究发现CKM基因在猪胚胎发育期间肌肉组织的相对表达量在藏猪里面最高，乌金猪次之，大约克猪的表达量最低[14]结果相吻合。在本研究中，CKM基因在藏猪肝脏组织的mRNA表达水平显著高于大约克猪(P<0.01)，肝脏调控机体代谢功能，基于CKM基因在细胞能量代谢中发挥重要作用，充分说明藏猪较大约克猪抗逆性强的特点[19]。CKM基因在藏猪和大约克猪的背脂表达水平存在显著差异(P<0.05)，推测可能与瘦肉型和脂肪型猪种有关。藏猪属于脂肪性猪种，CKM基因的低表达促进藏猪脂肪沉积，大约克猪属于瘦肉型猪种，CKM基因在大约克猪背脂的高表达会抑制其脂肪沉积。具体分子调控机制还需要进一步讨论。

4 结 论

综上所述，本研究通过对CKM基因起始密码子上游3 kb区域进行SNPs挑选，发现了单核苷酸多态性位点C-1185T和C-1324T，且该位点符合哈迪-温伯格定律(P>0.05)。实时荧光定量PCR结果显示，CKM基因在藏猪和大约克猪存在显著差异表达，尤其CKM基因在藏猪背最长肌中的mRNA表达量极显著高于大约克猪(P<0.01)。CKM基因在不同品种3个组织的表达水平说明CKM基因与骨骼肌的生长发育呈负相关。本研究通过对CKM基因多态性及表达模式的分析，为进一步研究CKM基因对于猪的生长发育以及产肉能力提供理论依据，为藏猪种质资源保护提供参考。