Usher综合征Ⅰ型家系的MYO7A基因变异分析

严提珍 黄钧 袁德健 唐向荣 韦笑宝 罗世强

作者单位：1 柳州市妇幼保健院医学遗传科 柳州 545001

2 柳州市出生缺陷预防与控制重点实验室 柳州 545001

3 柳州市生殖医学重点实验室 柳州 545001

4 柳州市妇幼保健院耳鼻喉科、听力诊断中心 柳州 545001

5 柳州市妇幼保健院眼科 柳州 545001

Usher综合征（Usher syndrome，USH）是一组以先天性感音神经性耳聋、渐进性视网膜色素变性引起视力障碍、视野缩小为主要临床表现的常染色体隐性遗传性疾病，发病率约为3.3～16.6/100000[1]。依据临床表现的严重程度，可分为I型、II型和III型，其中I型症状最为严重，主要表现为先天性重度或极重度感音神经性耳聋，前庭功能障碍，在青少年时期可引发不同程度的视网膜色素变性[1]。Usher综合征具有高度临床表型和遗传异质性，目前明确可与Usher综合征I型相关的基因有5个（MYO7A、CDH23、USH1C、USH1G、PCDH15）[1]，其中MYO7A基因变异发生率最高[2]；与Usher综合征II型相关基因有3个（USH2A、GPR98和DFNB31）；CLRN1基因与Usher综合征III型相关[1]。临床上Usher综合征主要通过听力检测、眼科检查结合基因检测诊断。本研究通过高通量测序及Sanger测序，发现一个由MYO7A基因c.3631-1G＞C和c.6049C＞T(p.Q2017*)复合杂合变异导致的Usher综合征I型家系，报告如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

研究对象为先证者及其家系成员，先证者为一名14岁女性，因耳聋和视力异常来我院进行检查，家系成员包括父母、姐姐、妹妹和弟弟（图1）。本研究已获得了柳州市妇幼保健院医学伦理委员会批准，研究对象均签署知情同意书。采集先证者及家系成员的病史（包括出生史、耳聋和眼睛病史、用药史、家族史等），进行系统检查：对先证者及其弟弟进行声导抗、纯音测听、听觉脑干诱发反应（ABR）、畸变产物耳声发射（DPOAE）检查，对其他家系成员进行声导抗和纯音测听；眼科检查包括视力、眼底视野视网膜电图等。

图1 Usher综合征家系系谱图

1.2 方法

1.2.1 样本采集和DNA提取 采集先证者及家系成员EDTA-Na抗凝的外周血4 mL，使用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取试剂盒（德国QIAGEN公司）进行基因组DNA提取（操作步骤参照试剂盒说明书）。

1.2.2 医学外显子组测序 用Q800R超声破碎仪将质检合格的基因组DNA打断成片段，打断后DNA片段大小在500 bp以下，峰值约在350 bp。参照NGS文库制备试剂盒（美国Illumina系统）条件及方法进行文库构建，将质检合格的文库稀释至上机测序浓度，完成自动的簇生成及双端测序（美国Illumina HiSeq4000测序仪），通过多种生物信息学软件对测序数据进行分析。结合家系患者的临床表型，对于筛查出来的潜在变异位点，通过检索相关数据库（如HGMD、PubMed、ESP、ClinVar、ExAC库和千人数据等）来判断变异位点的致病性。根据美国医学遗传学学会（American college of medical genetics，ACMG）遗传变异分类标准与指南[3]，对变异位点进行评估和致病性分类。

1.2.3 Sanger测序验证变异位点 针对候选变异位点引物，c.3631-1G＞C变异位点引物序列为F：5’-CTGTGAAGGGGTATGGGGAG-3’和R：5’-TGAGGGTAGGTGTCTGAGGA-3’；c.6049C ＞T 变异位点引物序列为F ：5’-TGACACACAGAAACCCCTTC-3’和R：5’-TACAAGGATCAGGGGTTGGG-3’。对先证者及其家系成员的DNA样本进行PCR扩增，PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，纯化定量后，送上海立菲生物技术有限公司进行测序检测（美国ABI 3730xl DNA测序仪），测序结果用DNAStar软件的SeqMan与野生型进行序列比对。

1.2.4 氨基酸保守性分析 通过在线软件ClustalW2（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）对6个物种目标氨基酸序列进行保守性比对分析。氨基酸序列包括：NP_000251.3（Homo sapiens，人）、NP_001243010.1（Mus musculus，小鼠）、XP_006229806.1（Rattus norvegicus，褐家鼠）、XP_038285928.1（Canis lupus familiaris，犬）、XP_011717460.1（Macaca nemestrina，猕猴）、XP_016777155.2（Pan troglodytes，黑猩猩）。

2 结果

2.1 病史及全身体格检查结果

该家系符合常染色体隐性遗传的特征（图1），先证者（II-2）听力检查结果发现ABR＞100 dB HL，而耳声发射不能引出（排除听神经病），双耳纯音听阈均＞100 dB HL，为极重度感音神经性耳聋，伴有前庭功能减退（运动发育迟缓，患儿坐立均迟于正常同龄儿，1岁会坐，2岁5个月会走路，缺乏运动技能，不能跑步骑车，冷热水试验无反应）。眼科检查结果显示视网膜电图无反应，b波消失，提示为视网膜色素变性（图2），依据先证者典型的临床表现，临床初步诊断为Usher综合征I型。先证者弟弟（II-4）检查结果也表现为极重度感音神经性耳聋，但还表现为牙齿发育不良、两边眼球大小不一致（左眼球偏小）、斜视、斗鸡眼，无视网膜变性病变。先证者父母（I-1和I-2）、姐姐（II-1）和妹妹（II-3）未出现与先证者类似表型。

2.2 先证者及其他家系成员的测序结果

图2 先证者双眼视网膜色素变性

高通量测序检测和分析结果提示，先证者及其弟弟为MYO7A基因c.3631-1G＞C和c.6049C＞T(p.Q2017*)复合杂合变异（图3 II-2和II-4），通过拷贝数和SNP分析，没有检测到与临床表现可能相关的拷贝数变异。经过Sanger测序验证显示这两个变异位点分别来自先证者的父母（图3 I-1和I-2），先证者姐姐（图3 II-1）和妹妹（图3 II-3）均携带MYO7A c.3631-1G＞C杂合变异。

2.3 致病性及保守性分析

c.6049C＞T变异位点第2017位氨基酸谷氨酰胺在人、小鼠、褐家鼠、犬、猕猴、黑猩猩多个物种之间高度保守（见图4）。

3 讨论

图3 USH综合征家系Sanger测序结果

图4 保守性分析结果

MYO7A基因相关疾病为常显遗传性耳聋11型、常隐遗传性耳2型和Usher综合征1型[4，5]，是常染色体显性/隐性遗传。常显遗传性耳聋11型临床特征主要为语后渐进性听力损失；常隐遗传性耳聋2型临床特征主要为语前和语后重度听力损失；Usher综合征I型临床特征主要为先天性重度或极重度感音神经性听力损失，青春期前视网膜色素变性，伴或不伴前庭功能异常[1]。本例先证者及其弟弟有共同的临床表型，均表现为极重度感音神经性耳聋、前庭功能障碍，但临床表型存在差异，先证者还表现为视网膜色素变性，而其弟弟6岁，无视网膜色素变性病变（可能与年龄有关，后续需密切随访其视力和眼底检查情况），同时具有牙齿发育不良、两边眼球大小不一致（左眼球偏小）、斜视、斗鸡眼等临床表型，这些额外的临床症状在Usher综合征病例中未见报道，提示可能存在其他基因变异或拷贝数变异。该家系两个患者基因型相同，但临床表型有所不同，提示Usher 综合征具有高度表型异质性。

MYO7A基因位于染色体11q13.5区域，含49个外显子，编码2215个氨基酸，编码蛋白属于肌球蛋白家族（myosin 7A），该蛋白为马达蛋白，具有ATP酶活性，可利用水解ATP产生的动能，与肌动蛋白结合，沿着肌动蛋白丝运动[1，5]。该蛋白结构域有3个重要区域：①氨基末端（即马达区域，是肌球蛋白的核心功能区，可与肌动蛋白结合，主要功能是水解ATP和产生动能）；②调节区（即颈部，可与肌球蛋白轻链结合形成异亮氨酸-谷氨酰胺基序）；③羧基末端：（即尾部，分为SH3结构域、两个FERM结构域和两个MyTH4结构域，主要功能是调节MYO7A运动）。目前已报道超过500个MYO7A基因变异位点可导致Usher综合征I型或遗传性耳聋，变异类型覆盖无义变异、错义变异、移码变异、微缺失变异及剪接变异等[6]，分布于各结构域。王圣然等[7]报道了一个由MYO7A基因c.462C＞A和EX46_47 Del复合杂合变异导致常染色体隐性遗传非综合征耳聋的家系，其中c.462C＞A位于氨基末端，无义变异使得翻译提前终止，产生截短蛋白；EX46_47 Del变异导致了MYO7A羧基末端MyTH4-FERM结构域缺失。刘梦婷等[8]和林长亮等[9]报道的家系分别为c.3412C＞T (p.Q1138*)/c.4152G＞C(p.K1384N)和c.2694+2T＞G/c.6028G＞A复合杂合变异，这些变异可引发MYO7A基因编码蛋白质的结构和功能异常，从而导致下游信号转导异常或中断，最终患者出现Usher综合征I型临床症状。

本研究通过高通量测序和Sanger测序基因检测发现先证者及其弟弟均携带MYO7A基因c.3631-1G＞C和c.6049C＞T(p.Q2017*)复合杂合变异。MYO7A基因c.3631-1G＞C为剪接变异，没有在相关临床病例中被报道过，变异位于mRNA剪接区域，序列高度保守，多种计算机辅助算法预测变异可能会影响蛋白功能。依据ACMG变异分类指南[3]，该变异符合PVS1（当一个疾病的致病机制为功能丧失的无功能变异）+PM2（千人数据库、ESP数据库、EXAC数据库中正常对照人群中未发现的变异）+PM3（对于隐性遗传基因，在患者反式位置检测到致病或可能致病变异），可判定为致病。MYO7A基因c.6049C＞T (p.Q2017*)变异在耳聋相关临床病例中被报道过[10]。该变异为罕见无义变异，无义变异使得翻译提前终止，产生截短蛋白。该变异符合PVS1（同前）+PM2（同前）+PM3（PMID：23767834[10]），可判定为致病。

综上所述，本研究发现了一个MYO7A基因c.3631-1G＞C和c.6049C＞T复合杂合变异导致Usher综合征I型的家系。c.3631-1G＞C新变异丰富了MYO7A基因突变谱。本研究为该家系患者明确了临床诊断，为后续的遗传咨询、产前诊断或植入前遗传学诊断提供了依据。