导致HDR综合征的2例GATA3基因变异的致病性分析

李林珂 耿佳 申恬 钟鸣骏 熊文羽 赵海燕 卢宇, 袁慧军 刘世喜 孙艺

作者单位：1 四川大学华西医院耳鼻咽喉头颈外科 成都 610041

2 四川大学华西医院罕见病研究院 成都 610041

3 陆军军医大学第一附属医院医学遗传中心 重庆 400038

4 中部战区总医院耳鼻咽喉头颈外科 武汉 430070

耳聋是临床上常见的影响人类身心健康的疾病之一。据世界卫生组织统计，接近5亿的人口患有不同程度的听力损失。我国现有听力残疾患者2780万人，仅次于肢体残疾[1]。耳聋病因复杂，遗传因素是最主要的致病因素，约占60%[2]。遗传性耳聋可分为非综合征型耳聋和综合征型耳聋。截至2021年，遗传性耳聋网站（hereditaryhearingloss.org）已收录遗传性非综合征型耳聋基因123个。综合征型耳聋种类繁杂，目前已报道400余种。综合征型耳聋除耳聋的临床表现，还存在其他器官或系统异常。临床常见的综合征型耳聋包括Usher综合征、Waardenburg综合征、Alport综合征等。

本文通过对两个因感音神经性耳聋就诊的先证者进行临床表现分析，对这两个家系的样本进行已知耳聋基因二代测序，结合生物信息学分析结果，确定两个家系的致病基因突变位点分别为GATA3的c.186dup和c.835_836dup杂合变异，从而诊断为甲状旁腺功能减退-感音神经性耳聋-肾发育不良综合征（hypoparathyroidism-sensorineural deafnessrenal dysplasia，HDR）。目前这两个突变尚未有文献报道。

1 材料与方法

1.1 家系资料的采集

两家系来自湖北省，编号分别为HL-011154和HL-011258。两家系病史、临床信息及样本均由陆军军医大学第一附属医院医学遗传中心采集，并经过伦理委员会批准，签署知情同意书。

1.2 测序及变异位点分析

使用课题组自主设计的目标区域捕获试剂盒HHL-158检测，该试剂盒覆盖目前已知耳聋基因共158个。目标区域涵盖158个基因的外显子，外显子上下游50 bp及线粒体DNA序列。使用BWA软件对预处理后的数据与GRCh37/hg19比对，使用GATK和VEP工具对变异进行注释，最小等位基因频率以0.5%进行变异过滤。使用SIFT、Polyphen-2、LRT、MutationTaster、PhyloP、GERP++等进行变异对蛋白功能影响预测。

1.3 Sanger测序

针对检出的GATA3基因突变位点设计验证引物，对已采集样本的家系成员进行Sanger测序验证。通过Mutation-Surveyor软件进行序列比对，分析检出变异是否符合家系表型和基因型共分离。

1.4 致病性分析

根据美国医学遗传学与基因组学学会（the American college of medical genetics and genomics，ACMG）遗传性听力损失判读指南[3]，对检测出的GATA3突变位点进行致病性分析。

2 结果

2.1 HL-011154家系资料和相关表型描述

HL-011154为一散发耳聋病例，家庭共3人（图1A）。先证者父母I-1、I-2否认近亲结婚。父母诉先证者II-1在1岁时因发烧时用药后出现听力下降（具体药物不详）。8岁时第一次测听双耳重度感音神经性耳聋，20岁时测听双耳中-重度感音神经性耳聋，缓降型，高频损害为主（图1B），余未见明显异常。I-1及I-2自诉体健、听力正常。

2.2 HL-011258家系资料和相关表型描述

HL-011258为一散发耳聋病例，家庭共3人（图1C）。先证者父母I-1、I-2否认近亲结婚。父母诉先证者II-1在2岁时双耳听力差，1岁时会说话，言语清晰。1岁多因发烧曾使用庆大霉素治疗，具体不详。4岁时第一次测听双耳中度感音神经性耳聋，9岁时测听双耳中-重度感音神经性耳聋，缓降型，高频损害为主（图1D），余未诉明显异常。I-1及I-2自诉体健、听力正常。

2.3 致病基因鉴定

对两家系先证者进行测序分析，并使用软件进行注释、过滤后，在已知耳聋基因中均检出了GATA3基因杂合变异。HL-011154先证者II-1为GATA3基因NM_002051.2：c.186dup（NP_002042.1：p.Tyr63Leufs*240）杂合变异。HL-011258家系先证者II-1为GATA3基因NM_002051.2：c.835_836dup（NP_002042.1：p.Gly280Argfs*15）杂合变异。gnomAD数据库中均未见报道。

图1 A：HL-011154家系图；B：HL-011154先证者听力曲线；C：HL-011258家系图；D：HL-011258听力曲线

2.4 Sanger测序结果

Sanger测序验证HL-011154家系先证者II-1及HL-011258家系先证者II-1分别为GATA3基因c.186 dup和c.835_836dup杂合突变。通过HL-011258家系父母样本检测，结合先证者听力表型，c.835_836dup为新发突变。HL-011154家系父亲提供样本，母亲未提供样本无法进行检测。Sanger测序见图2。

3 讨论

本研究，报道了2个因感音神经性耳聋的就诊的散发病例。通过高通量测序在这两个家系中分别鉴定出GATA3基因两个新的致病性变异c.186dup和c.835_836dup。根据ACMG指南进行致病性分析，位于2号外显子的移码变异（c.186dup，p.Tyr63Leufs*240）致使位于第一个反式激活结构域（transactivating domain 1，TA1）之前高度保守的Tyr63突变为Leu63，引起240个氨基酸变化，导致多肽链的提前终止（PVS1），在HL-011154家系中该变异推测为新发突变（PS2），该突变位点gnomAD数据库人群频率未见报道（PM2），故将此变异判定为“致病变异”。位于4号外显子的移码变异（c.835_836dup，p.Gly280Argfs*15）致使位于第一个锌指结构域（zinc finger domain 1，ZnF1）上高度保守的Gly280突变为Arg280，引起15个氨基酸变化，导致多肽链的提前终止（PVS1），在HL-011258家系中该变异推测为新发突变（PS2），该突变位点gnomAD数据库人群频率未见报道（PM2），突变与听力表型在该家系中共分离（PP1），也将此变异判定为“致病变异”。

GATA3基因位于染色体10p14，包括6个外显子[4]，编码443个氨基酸（NM_002051.2）。GATA3蛋白属于参与胚胎发育的转录因子，在胚胎发育中的甲状旁腺、内耳和肾脏中表达，同时在胸腺、中枢神经系统和T细胞发育中起重要作用[5，6]。GATA3蛋白包含N端的2个反式激活结构域（TA1，TA2）和C端的2个锌指结构域（ZnF1，ZnF2）。ZnF2可以特异性识别DNA中的N-(A/T)GATA(T/G)-C序列，并与之结合[7]。ZnF1则稳定ZnF2与DNA的结合，并与多种锌指蛋白相互作用[8]。GATA3是目前唯一已知与HDR综合征相关的基因，其单倍剂量不足被认为是导致HDR综合征的潜在病因[9]，但也有文献报道GATA3过表达和显性负效应可引起HDR综合征的机制[10，11]。Ali等[12]基于HDR综合征将突变引起的功能异常分为三类：第一类是由于涉及ZnF2的突变导致DNA结合能力缺失，这类突变占GATA3的突变突变的90%以上突变类型；第二类是涉及ZnF1的突变导致DNA结合位点的亲和力下降；第三类是虽然未改变正常的DNA结合点和亲和力，但由于结合过程中DNA双螺旋构象的变化，最终导致与其他蛋白质的结合力降低[6]。既往文献共报道124个家系中93种不同GATA3突变，在这124个家系中，40%为移码突变，23%为错义突变，14%为无义突变，6%为剪接位点突变，1%为框内突变，15%为全基因组缺失，1%为全基因组重复[13]。93种突变分散在GATA3基因上，无明显突变热点。其中约50%的突变为发生在日本人群中的新发变异。本研究中，c.186dup在Tyr63发生框移，致使GATA3蛋白丢失后续结构域。c.835_836dup在Gly280（处于ZnF1）上发生框移，导致部分ZnF1改变，ZnF2丢失。这两家系中的结果均为GATA3基因框移突变后发生提前截短，引起GATA3结构域丢失，从而DNA的结合能力缺失。

图2 A：HL-011154先证者Sanger测序图谱；B：HL-011154父亲Sanger测序图谱；C：HL-011258先证者Sanger测序图谱；D：HL-011258父亲Sanger测序图谱；E：HL-011258母亲Sanger测序图谱

HDR综合征主要表现为甲状旁腺激素分泌不足、感音神经性耳聋和肾发育不良[14]。甲状旁腺激素分泌不足表现为有症状或无症状的低钙血症，发病率93.3%。肾发育不良包括肾发育缺乏、异型增生等，发病率约72.2%[15]。感音神经性耳聋是最为显著的特征，占96.7%，表现为双侧早发性中-重度听力下降，高频损害为主，且随年龄增长逐渐加重，听力曲线呈平坦型或缓降型[16，17]。HDR综合征临床表现具有明显异质性，囊括HDR综合征三个代表性特征的病例占64.4%，然而仅表现感音神经性耳聋占0.6%。本研究中两先证者均表现为孤立性感音神经性耳聋，耳聋特征与既往文献报道相似，且未发现明显的低甲状旁腺激素相关表现及肾脏相关异常。与c.835_836dup突变类似，Belge等[18]报道一例错义突变同样涉及ZnF1的病例（c.856A＞G），该患者也仅表现为孤立性感音神经性耳聋，表明在涉及结构域的突变可能会造成实质性的病症。HL-011154和HL-011258家系中患者分别于20岁和9岁时接受HDR综合征相关表型检查，目前暂未发现低甲状旁腺激素相关表现及肾脏相关异常，可能这与患者发病年龄相关，相关病症尚未得到外显。

本研究报道了2个仅表现为感音神经性耳聋的HDR综合征的新发变异患者。强调尽管HDR综合征的表型存在差异，但早期特异性诊断非常重要。对于在有家族史的同一家系中，建议进行严密的血钙检测和肾脏彩超检测，并进行基因遗传咨询。对于同时存在两个或两个以上典型特征的患者，HDR综合征很容易被诊断出。但表现为孤立性感音神经性耳聋的患者，易被忽视。常规的新生儿听力筛查虽然可以早期检测，但HDR综合征耳聋并不一定表现为先天性。因此，在排除获得性或其他遗传因素情况下，孤立性感音神经性耳聋患者可以考虑进行GATA3基因检测。建议将GATA3基因纳入高通量测序基因组筛查中，可以将不完全外显的病例中早期识别出，从而提高耳聋致病基因检出率，减少新生听障儿童的出生率，减轻家庭和社会负担。