高效液相色谱法同时测定化妆品中9 种4-羟基苯甲酸酯类防腐剂

邢海艳，孙丽，吴旭，鲁素雅，金鹏，金华

（淮安市食品药品检验所，江苏淮安 223005)

防腐剂是指天然或合成的化学成分，用于加入食品、药品、化妆品等以延迟微生物生长或化学变化引起的产品腐败，从而能够长久保持产品的安全性和稳定性［1–3］。化妆品富含水分、油脂、蛋白质、维生素、动植物提取物等各种营养活性物质，为微生物的生长提供了良好的条件，因此在化妆品中添加防腐剂是必不可少的。防腐剂的不当使用是导致皮肤过敏和接触性皮炎的第二大原因，仅次于香料［4–7］。《化妆品安全技术规范》（2015 年版）中规定了多种许可防腐剂，但只收载了部分防腐剂的检测方法［1，8］。4-羟基苯甲酸酯类化合物是化妆品中允许添加且经常使用的防腐剂，但其中4-羟基苯甲酸异丙酯、4-羟基苯甲酸异丁酯、4-羟基苯甲酸戊酯、4-羟基苯甲酸苯酯、4-羟基苯甲酸苄酯是禁用防腐剂。4-羟基苯甲酸酯类化合物被报道具有雌激素样作用，且4-羟基苯甲酸酯类化合物分子内部的碳键越复杂，防腐能力越强，对皮肤刺激性也会越强，因此对化妆品中此类化合物的检测具有重要意义［9–11］。

近年来，测定4-羟基苯甲酸酯类化合物的报道较多，主要有高效液相色谱法、液相色谱–质谱联用法、气相色谱–质谱联用法［12–16］。化妆品基质比较复杂，质谱法检测时易污染仪器，且对提取方法要求较高。目前高效液相色谱法主要针对4-羟基苯甲酸甲酯、4-羟基苯甲酸乙酯、4-羟基苯甲酸丙酯、4-羟基苯甲酸丁酯等准用防腐剂进行检测，国家标准收载了同时测定化妆品中7 种4-羟基苯甲酸酯的方法［17］，但采用高效液相色谱法同时测定化妆品中9 种4-羟基苯甲酸酯类防腐剂尚未见报道。笔者以甲醇溶解样品，对样品处理条件和色谱条件进行优化，在此基础上，建立了高效液相色谱法同时测定化妆品中9 种4-羟基苯甲酸酯类防腐剂的方法。该方法操作简便、准确度和灵敏度高，为化妆品中此类防腐剂的检测与监管提供新的思路和方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Waters 2695／2998 型，美国Waters 公司。

超声清洗仪：KQ–250DV 型，昆山市超声仪器有限公司。

超纯水机：美国Millipore 公司。

有机系针筒式微孔滤膜：孔径为0.45 μm，上海安谱公司。

电子天平：XP–6 型，感量为0.001 mg，瑞士梅特勒–托利多科技有限公司。

电子天平：XS205DU 型，感量为0.01 mg，瑞士梅特勒–托利多科技有限公司。

磷酸：色谱纯，上海麦克林试剂公司。

甲醇、乙腈：色谱纯，德国默克公司。

4-羟基苯甲酸酯类标准物质：基本信息见表1。

1.2 仪器工作条件

色谱柱：Waters Symmtery C18柱（2.1 mm×250 mm，5 μm，美国Waters 公司）；流动相：A 相为0.1%磷酸溶液，B 相为乙腈，按表2 进行梯度洗脱；流量：1.0 mL／min；柱温：30 ℃；检测器：二极管阵列检测器；检测波长：254 nm；进样体积：10 μL。

1.3 溶液配制

分别称取9 种4-羟基苯甲酸酯类标准物质各25 mg，用甲醇溶解稀释，配制成9 种防腐剂的质量浓度均为0.5 mg／mL 的混合标准溶液。依次移取0.002、0.004、0.02、0.05、0.1、0.2、0.4、2 mL 上述混合标准溶液，分别置于8 只10 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至标线，配制成9 种防腐剂的质量浓度均分别为0.1、0.2、1、2.5、5、10、20、100 μg／mL 的 系 列 混合标准工作溶液。

1.4 样品处理

取化妆品样品1.0 g，置于25 mL 具塞试管中，加入甲醇20 mL，超声提取30 min，放置冷却，加入甲醇稀释至25 mL，静置，过滤，取续滤液待测。

2 结果与讨论

2.1 溶剂选择

参考《化妆品安全技术规范》（2015 年版）第四章中防腐剂检测的提取溶剂［1］，比较了甲醇、体积分数为50%的甲醇溶液、乙腈作为提取溶剂时的回收率，结果列于表3。由表3 可知，使用以上3 种溶剂提取时，样品的回收率均大于70%。考虑到配制试剂需简便、低毒性，且甲醇极性大于乙腈，易提取，回收效果好，因此选择甲醇作为提取溶剂。

表3 不同提取溶剂时的回收率（n=3） %

2.2 取样量选择

比较了取样量为0.5、1.0、2.0 g 时样品的回收率，结果列于表4。由表4 可知，不同取样量时的回收率差异不明显，故取样量对样品提取效率影响较小。为避免样品量大时污染色谱系统，或取样量不足导致检测结果小于定量限等情况的发生，检测时将取样量定为1.0 g，如遇不同样品时可适当调整取样量或稀释样品。

表4 不同取样量时的回收率（n=6） %

2.3 提取时间选择

选取含有4-羟基苯甲酸甲酯的阳性样品，以甲醇为溶剂，分别超声5、10、15、20、25、30、45、60 min，测定并计算提取效率。试验结果表明，4-羟基苯甲酸甲酯极性较大，易溶于甲醇，超声5 min 后即可完全提取，为确保其它8 种防腐剂提取完全，选择超声时间为30 min。

2.4 色谱条件选择

《化妆品技术安全规范》（2015 年版）4.7 中分离12 种防腐剂采用的流动相为0.05 mol／L 磷酸二氢钠溶液–甲醇–乙腈（50∶35∶15），添加浓度为0.002 mol／L 的氯化十六烷三甲胺溶液，并用磷酸调节pH 至3.5。该流动相配制复杂，各组分保留时间批间偏差较大。本实验选择0.1%磷酸溶液–乙腈为流动相，梯度洗脱。该流动相体系配制简单，重现性好，批间差异较小。对各组分进行光谱分析，试验结果表明，最大吸收波长在254 nm 附近，故检测波长选择254 nm。取1.3 中质量浓度为20 μg／mL的9 种4-羟基苯甲酸酯类防腐剂混合标准溶液，在选定的色谱条件下进样测定，结果如图1 所示。由图1 可知，9 种防腐剂分离良好。

图1 20 μg／mL 混合标准溶液色谱图

2.5 线性方程、检出限与定量限

在1.2 液相色谱条件下，对1.3 中的系列混合标准工作溶液进行测定，以待测防腐剂的质量浓度（x）为横坐标，以色谱峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线，计算线性方程、相关系数。取2 份阴性样品，各1.0 g，分别加入不同浓度的9 种防腐剂混合标准溶液，按照1.4 方法处理样品，在1.2 仪器工作条件下进行测定，以3 倍信噪比（S／N）时样品中待测防腐剂含量为检出限，以10 倍信噪比（S／N）时待测防腐剂含量为定量限。9 种防腐剂的线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限表5。

表5 9 种防腐剂的线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限

2.6 加标回收与精密度试验

分别取粉质基质、水质基质阴性样品各1.0 g，分别加入1.25、2.5、12.5 mL 质量浓度为0.5 mg／mL 的9 种4-羟基苯甲酸酯类防腐剂混合标准溶液，按1.4方法处理样品，制备成9 种4-羟基苯甲酸酯类防腐剂的质量浓度均分别为25、50、250 μg／mL 的加标样品溶液，每个浓度点平行制备6 份，在1.2 液相色谱条件下进行测定，结果见表6。由表6 可知，粉质类样品中各组分的平均回收率为97.69～104.06%，测定结果的相对标准偏差为0.92%～4.80%，水基质类

样品中各组分的平均回收率为95.73%～103.36%，测定结果的相对标准偏差为0.58%～5.28%，表明该方法具有良好的准确度和精密度。

表6 加标回收与精密度试验结果

2.7 实际样品分析

对市售的15 批化妆品进行测定，代表性的精华露样品色谱图如图2 所示，由图2 可知，化妆品中基质未干扰目标物的测定。15 批样品的检测结果见表7。由表7 可知，化妆品中常用防腐剂为4-羟基苯甲酸甲酯、4-羟基苯甲酸乙酯和4-羟基苯甲酸丙酯，3 者的含量均未超过规定（4-羟基苯甲酸甲酯、4-羟基苯甲酸乙酯质量分数均小于0.4%，4-羟基苯甲酸丙酯、4-羟基苯甲酸丁酯质量分数均小于0.14%，均按4-羟基苯甲酸甲酸计，总计不得超过0.8%。），未检出禁用的5 种对羟基苯甲酸酯类防腐剂。

图2 精华露样品色谱图

表7 15 种市售化妆品中4-羟基苯甲酸酯类防腐剂含量检测结果 μg／g

3 结语

建立了同时测定化妆品中9 种4-羟基苯甲酸酯类防腐剂的高效液相色谱法，以甲醇为溶剂，超声提取，以C18色谱柱为分离柱，用二极管阵列检测器分析。该方法提取简便，分离效果好，灵敏度高，专属性强，准确度高，可满足此类防腐剂的检测要求，为化妆品监管和检测提供新的方法。